高活力產(chǎn)中性蛋白酶細菌菌株的選育及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、本研究系統(tǒng)研究了產(chǎn)中性蛋白酶菌株的菌種選育、原生質(zhì)體復(fù)合誘變及產(chǎn)酶條件、酶學(xué)性質(zhì)和菌種保藏以及酶的保藏。 本研究論文主要包括四個方面的內(nèi)容： (1)產(chǎn)中性蛋白酶細菌的篩選及部分酶學(xué)性質(zhì)的初探 從土壤中分離純化得到一株產(chǎn)中性蛋白酶菌株Bx-4，經(jīng)初步鑒定為枯草芽孢桿菌。比較篩選了酪素培養(yǎng)基、淀粉酪素培養(yǎng)基、酵母膏酪素培養(yǎng)基、LB+酪素培養(yǎng)基、脫脂奶粉培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)以脫脂奶粉培養(yǎng)基作為鑒別培養(yǎng)基效果較好。單因素碳、氮源

2、及正交試驗發(fā)現(xiàn)以2％玉米粉、3％豆粕粉作為碳、氮源并輔以3％麩皮作為生長因子產(chǎn)酶最好。Zn2+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+等對產(chǎn)酶也有不同程度的激活作用，以其中Zn2+激活作用最明顯。Fe2+對產(chǎn)酶有強抑制作用。產(chǎn)酶最佳起始pH為8.0。酶學(xué)性質(zhì)初步研究發(fā)現(xiàn)酶最適作用溫度為55℃，最適作用pH為7.5，Ca2+對酶有一定的激活作用和穩(wěn)定作用，F(xiàn)e3+對酶有強烈的抑制作用。 (2)BacillussubtilisBx-4原生

3、質(zhì)體復(fù)合誘變選育產(chǎn)酶菌株 BacillussubtilisBx-4菌體生長滯后期為0-2h，7h后達到了菌種的對數(shù)生長末期，對數(shù)生長中期為5hr左右。BacillussubtilisBx-4對甘氨酸與青霉素非常敏感。甘氨酸最適作用濃度為2mg/mL，青霉素作用單位為1U/mL，溶菌酶作用最適濃度為2mg/mL，時間為60min。在優(yōu)化條件下進行原生質(zhì)體形成與再生綜合實驗，形成率和再生率均分別平均達到77.44％和53.07％。B

4、acillussubtilisBx-4原生質(zhì)體對紫外線作用不太敏感。紫外誘變篩選得到正突變株UV11。UV11經(jīng)UV+HN02誘變選育得到正突變株UN9。UN9再經(jīng)UV+NTG復(fù)合誘變得到一株高產(chǎn)、穩(wěn)定的中性蛋白酶菌株并命名為BacillussubtilisPromaxNTG14，酶活達4286.09U/mL。遺傳穩(wěn)定性研究表明，BacillussubtilisPromaxNTG14具有良好的遺傳穩(wěn)定性，傳代5次酶活均保持在4000U/

5、mL以上。 (3)BacillussubtilisPromaxNTG14產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)研究 BacillussubtilisNTG14以玉米粉+甘油為復(fù)合碳源，以豆粕粉做為氮源，麩皮提供生長因子時產(chǎn)酶最好。選用L16(45)正交試驗表進行正交試驗，研究結(jié)果表明以2％玉米粉、2％甘油、3％豆粕粉、3％麩皮作為碳、氮源配比時對產(chǎn)酶最為有利。極差分析發(fā)現(xiàn)豆粕粉對產(chǎn)酶影響最為顯著，甘油和玉米粉次之，麩皮對產(chǎn)酶影響最小。正交試

6、驗結(jié)果方差分析表明，甘油和玉米粉對產(chǎn)酶影響顯著(P＜0.05)。豆粕粉影響極顯著(P＜0.01)。麩皮對產(chǎn)酶影響不顯著(P＞0.05)。Ca2+、Mg2+、Na+、Zn2+、Mn2+對產(chǎn)酶有不同程度的激活作用，特別是Ca2+激活作用最強。Fe3+、Fe2+、K+以及Ag+對酶有強抑制作用，特別是Ag+。最適搖瓶裝料量為50mL/300mL。最適起始pH為7.5。以24h菌齡、3％接種量產(chǎn)酶最好。表面活性劑對產(chǎn)酶有激活作用，但作用不明顯。

7、發(fā)酵過程參數(shù)動態(tài)變化顯示，酶生物合成隨培養(yǎng)時間的延長呈明顯的上升趨勢，培養(yǎng)46h時達到最高。菌種生物量在培養(yǎng)的前16h呈上升趨勢。之后呈下降趨勢。pH動態(tài)過程顯示，在培養(yǎng)初期有一個急劇下降的過程，隨后pH呈上升趨勢，一直到產(chǎn)酶高峰階段pH均在pH7.5左右。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，酶最適作用溫度為50℃。酶的熱穩(wěn)定性較好。最適作用pH為7.5。Zn2+和Mn2+對酶有激活作用，特別是Zn2+。Mn2+對酶激活作用不明顯。Ca2+、Na+、K+

8、、Mg2+、Fe2+、Fe3+等對酶有不同程度的抑制作用。以Fe2+最為顯著。酶有一定的耐氧化能力。耐甲醇能力極差。有一定的耐乙醇能力。表面活性劑有利于提高酶的催化能力但作用不明顯。酶催化動力學(xué)研究表明，酶的Vmax為20.72μg/mL，Km為16.67μ.g/mL。 (4)酶保存初步研究 以7％明膠、2％丙二醇、4％甘油、0.1％ZnCl2作為酶保藏液時，酶活保存時間相對較長。方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，明膠、丙二醇、ZnCl