中性蛋白酶發(fā)酵過(guò)程代謝物動(dòng)態(tài)變化的研究.pdf

1、分類號(hào)：[Q815]密級(jí)：不保密學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號(hào)：12809004中性蛋白酶發(fā)酵過(guò)程代謝物動(dòng)態(tài)變化的研究StudyontheDynamicChangesofMetabolitesDuringFermentationProcessofNeutralProtease專業(yè)名稱：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師姓名：路福平教授研究生姓名：楊泓酤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：工學(xué)碩士論文提交日期：2015年5月論文課題來(lái)源：863計(jì)劃項(xiàng)目學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)

2、摘要芽胞桿菌屬微生物發(fā)酵生產(chǎn)的中性蛋白酶在食品、釀造、紡織、化工等工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用，全面深入地研究其發(fā)酵過(guò)程，能夠促進(jìn)發(fā)酵工藝的理性優(yōu)化和改良，對(duì)于降低其生產(chǎn)成本具有重要的意義。本研究致力于解析芽胞桿菌ASl398(肋cf刀淞J甜6，玎括ASl398)中性蛋白酶發(fā)酵工程中胞內(nèi)、胞外物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，首先利用氣相一質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)技術(shù)建立了移s甜6ff凰ASl398菌種的代謝組分析方法，然后通過(guò)該方法對(duì)中性蛋白酶發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)外代謝

3、物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了探索研究，并從中尋找限制發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)酶水平的關(guān)鍵氨基酸種類。具體研究工作包括如下幾個(gè)方面：(1)通過(guò)比較建立了適合枯草芽胞桿菌的基于GCMS的代謝組學(xué)分析方法，著重考察了淬滅方法、細(xì)胞破碎方法和衍生時(shí)間三個(gè)條件，最終確定了適合的代謝組樣品前處理方法：采用預(yù)冷的60％甲醇／09％碳酸銨溶液淬滅、珠磨法破碎細(xì)胞和MSTFA衍生2h，該方法從枯草桿菌中共鑒定到223種代謝物，包含了大量的氨基酸、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。(2)利用L

4、B培養(yǎng)基對(duì)丑J甜施脅ASl398進(jìn)行清液搖瓶發(fā)酵，每隔2h采樣測(cè)定生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶活力變化，并進(jìn)行基于GCMS的代謝組分析。生長(zhǎng)曲線顯示，菌體在前12h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，1218h處于穩(wěn)定期。產(chǎn)酶活力曲線顯示，發(fā)酵210h產(chǎn)酶活力速度提高，1022h緩慢提高。代謝組分析分別檢測(cè)到胞內(nèi)外123種和104種物質(zhì)在22h發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)PCA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外賴氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸物質(zhì)存在顯著變化，暗示他們與發(fā)酵和產(chǎn)酶進(jìn)程存在

5、密切的關(guān)系。(3)采用溶解性較差的工業(yè)培養(yǎng)基對(duì)Bs甜6療凰ASl398進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶活力變化，并進(jìn)行基于GCMS的代謝組分析。生長(zhǎng)曲線顯示，前6h為停滯期，1238h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，38h之后，進(jìn)入穩(wěn)定期。產(chǎn)酶活力曲線顯示，產(chǎn)酶活力前18h緩慢提高，1836h提高速度明顯加快，第36h時(shí)達(dá)到最高4232U／mL，之后開(kāi)始降低。代謝組分析分別共檢測(cè)到細(xì)胞外121種物質(zhì)在42h內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)PCA統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外賴氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸物質(zhì)存在顯著變化，暗示他們與發(fā)酵和產(chǎn)酶進(jìn)程存在密切的關(guān)系。(4)結(jié)合代謝物動(dòng)態(tài)變化分析結(jié)果，根據(jù)豆粕培養(yǎng)基的氨基酸組成和中性蛋白酶的氨基酸組成，分析發(fā)酵過(guò)程中氨基酸的供應(yīng)比例和需求比例之間的平衡性，推測(cè)可能由于蛋氨酸、賴氨酸、谷氨酸和組氨酸的供應(yīng)不足限制了中性蛋白酶的生物合成。針對(duì)這些推測(cè)，通過(guò)補(bǔ)加氨基酸的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加075％的蛋氨酸能夠提高酶表達(dá)量673％，添加O5％的