呋喃妥因代謝物酶免疫分析方法的研究.pdf

1、硝基呋喃類藥物及其代謝物具有強(qiáng)毒性和致癌致畸性，殘留于動(dòng)物源性食品中會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生巨大危害。因此，許多國家已將硝基呋喃類藥物列為禁用藥物，并規(guī)定在動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物不得檢出。但由于其成本低廉，藥效明顯，仍有不法分子為牟取暴利繼續(xù)使用。呋喃妥因是硝基呋喃類藥物之一，目前，針對(duì)呋喃妥因代謝物（AHD）殘留的檢測(cè)多采用儀器檢測(cè)分析法，這些方法雖然準(zhǔn)確、靈敏，但需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員操作，而且耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，不適用于

2、大量樣品的快速篩查。因此，建立一種便捷、快速、靈敏的 AHD殘留檢測(cè)方法，對(duì)于迅速控制食品安全風(fēng)險(xiǎn)，保障人民群眾飲食健康安全具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立了檢測(cè)AHD殘留的酶免疫分析法，即化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)和酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）。
　　首先，采用對(duì)醛基苯甲酸將AHD衍生化為半抗原CPAHD，并在此基礎(chǔ)上采用活化酯法將CPAHD與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原；分別用活化酯法和混合酸酐法將CPAHD與辣根過氧化物

3、酶（HRP）偶聯(lián)合成了兩種酶標(biāo)抗原。通過直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，優(yōu)選出采用活化酯法制備的酶標(biāo)抗原靈敏度更高，更加符合CLEIA法和ELISA法的實(shí)驗(yàn)要求。
　　其次，建立了AHD的間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法和直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法，并對(duì)化學(xué)發(fā)光液、包被條件、封閉液和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，間接法中優(yōu)選了包被原與抗體的最適稀釋度、直接法中優(yōu)選了抗體與酶標(biāo)抗原的最適稀釋度。結(jié)果表明，間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法和直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法的IC50分別為0

4、.753ng/mL和0.539ng/mL；特異性良好，除對(duì)呋喃妥因原藥存在一定交叉反應(yīng)外，對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似物及衍生化試劑均無交叉反應(yīng)；準(zhǔn)確性和精密度良好，對(duì)豬肉、雞肉和魚肉樣品的添加回收率在84.9％~103.4%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于12%；間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法對(duì)豬肉、雞肉和魚肉的最低檢測(cè)限分別為0.020、0.021和0.019μg/kg，直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法對(duì)豬肉、雞肉和魚肉的最低檢測(cè)限分別為0.013、0.013和0.01

5、2μg/kg。
　　第三，建立了AHD的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，并對(duì)顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其余優(yōu)化條件項(xiàng)目與CLEIA法相同。結(jié)果表明，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的IC50分別為2.186ng/mL和1.291ng/mL；特異性良好，除對(duì)呋喃妥因原藥存在一定交叉反應(yīng)外，對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似物及衍生化試劑均無交叉反應(yīng)；準(zhǔn)確性和精密度良好，對(duì)豬肉、雞肉和魚肉樣品的添加回收率在82.6%~104.7%之間，批內(nèi)

6、和批間變異系數(shù)均小于13%；間接競(jìng)爭(zhēng) CLEIA法對(duì)豬肉、雞肉和魚肉的最低檢測(cè)限分別為0.219、0.214和0.208μg/kg，直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法對(duì)豬肉、雞肉和魚肉的最低檢測(cè)限分別為0.115、0.113和0.109μg/kg。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的 AHD酶免疫分析法，其靈敏度、準(zhǔn)確性、精密度及最低檢測(cè)限均能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求。其中 CLEIA法的靈敏度和最低檢測(cè)限均優(yōu)于ELISA法，直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法又比