疾病代謝物的色譜-質(zhì)譜分析方法研究.pdf

1、近年來，隨著人類基因組測序工作的完成，人們對生命過程的理解有了很大的提高；人類越來越關注自身的健康狀況以及生命質(zhì)量。在科學領域，研究的熱點也由此轉(zhuǎn)移到基因的功能和幾個“組學”研究，包括研究核糖核酸(RNA)轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄組學、研究某個過程中所有蛋白及其功能的蛋白組學、研究代謝產(chǎn)物的變化及代謝途徑的代謝組學。
　　 代謝組學是繼“基因組學”、“轉(zhuǎn)錄組學”、“蛋白組學”之后新興的又一門“組學”研究。代謝物組中，有一類異常新陳代謝物與

2、疾病息息相關。正如大自然中生物個體之間和生物體內(nèi)部的化學聯(lián)系是一個普遍規(guī)律，人體內(nèi)部也時刻通過生物化學信號物質(zhì)進行聯(lián)系。當人體發(fā)生疾病時，新陳代謝相應出現(xiàn)異常，血液、尿液、組織以及呼吸氣體中會相應出現(xiàn)異常代謝物，而疾病化學標志物顧名思義就是可以作為指針與疾病各個病理階段相關聯(lián)。分析這些疾病相關的化學信號物質(zhì)已經(jīng)成為臨床診斷疾病的一種重要手段。生物醫(yī)學研究結(jié)合分析化學、生命科學、醫(yī)學等學科進行人類重大疾病的篩查、診斷、治療已成為當前研究的

3、熱點。發(fā)展色譜質(zhì)譜新技術新方法發(fā)現(xiàn)并分析人體生物化學信號物質(zhì)對重大疾病進行篩查和預警已經(jīng)成為其重要的方向之一。
　　 本論文以重大疾病(糖尿病、肺癌、新生兒遺傳代謝疾病等)血液和組織中疾病化學標志物分離和鑒定為研究內(nèi)容。該研究有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。對肺癌病人的血液進行固相微萃取GC-MS頂空分析，發(fā)現(xiàn)并論證肺癌標記物分子，為肺癌開辟了一條新的、能夠用于早期診斷的途徑；并進一步發(fā)展了液滴衍生微萃取技術與GC-MS聯(lián)用技術，分

4、析癌癥以及新生兒遺傳代謝疾病病人血液、尿液中小分子代謝物，首次發(fā)現(xiàn)了癌癥潛在早期標志物--己醛和庚醛；通過肝病不同階段的病理模型以及隨訪跟蹤病人，運用該方法進一步論證了己醛和庚醛作為癌癥早期預警信號物質(zhì)的作用。而對于新生兒遺傳性有機酸尿癥，我國兒童醫(yī)學在新生兒篩查此類病癥方面一直處于空白，我們運用了液滴微萃取技術與GC-MS聯(lián)用，應用于幾類典型的新生兒有機酸尿癥研究，結(jié)果表明該方法快速簡便，定量準確，是潛在的臨床早期篩查手段。
　

5、　 本論文共分四章。主要內(nèi)容摘要如下：
　　 第一章論述了代謝組學的定義、研究范疇以及在藥學、微生物學、毒理學、臨床學等各方面的廣泛應用與重要性。闡述了人體疾病信號物質(zhì)研究對于重大疾病早期診斷和預警的理論和實際意義。此外還綜述了疾病化學信號物質(zhì)的分析方法，復雜體系樣品前處理的方法以及建立合適動態(tài)模型的重要性和必要性。提出了本論文的研究目標和選題意義。
　　 第二章的工作中，首先發(fā)展了色譜質(zhì)譜技術分析重大癌癥以及肝病的生

6、物標志物，初步建立了早期篩查與預警癌癥與肝病的簡單、可靠的方法。發(fā)展了頂空固相微萃取方法分析病人血樣中揮發(fā)性小分子代謝物；針對小分子羰基化合物，比較多種衍生試劑，進一步發(fā)展了定量分析小分子醛酮化合物的原位衍生化固相微萃取GC-MS方法，首次發(fā)現(xiàn)了癌癥病人血液中己醛與庚醛含量異常，為正常人血液中含量的10倍以上，我們認為己醛與庚醛為癌癥病人體內(nèi)代謝異常的標志指針。我們通過建立不同階段肝病病癥的病人模型，動態(tài)跟蹤隨訪病人，分析病人血液中小分

7、子醛酮的含量，進而驗證了己醛及庚醛與癌癥的相關性。衍生固相微萃取與GC-MS方法聯(lián)用，具有快速、無害、簡單、準確的優(yōu)點，解決了傳統(tǒng)方法難以準確定量分析揮發(fā)性強的小分子羰基化合物的問題。
　　 第三章在第二章原位衍生固相微萃取技術的基礎上，進一步發(fā)展了液滴衍生微萃取技術與GC-MS聯(lián)用分析重大疾病血樣中小分子羰基化合物。論文首先綜述了近年來液液(微)萃取技術的發(fā)展與應用，設計了簡便的液滴微萃取設備并與固相微萃取技術進行比較，兩者各

8、有其優(yōu)缺點。固相微萃取無需有機溶劑、對環(huán)境友好，但缺點是成本較高、萃取頭容易損壞、進樣易殘留；液滴微萃取技術與其相比優(yōu)點是成本低廉、毒性溶劑僅使用微升級別可忽略不計，集萃取、衍生、進樣于一步驟，缺點則是與固相微萃取相比操作需要訓練，該方法適用于大量樣本篩查，大大降低成本。本章發(fā)展了一系列液滴萃取方法：(1)液滴微萃取溶液內(nèi)衍生化-GC/MS分析癌癥病人血液中羰基化合物，試驗結(jié)果與固相微萃取技術可較好吻合，檢測限略高，但足夠滿足血樣中實際

9、濃度分析。(2)液滴內(nèi)衍生微萃取-GC/MS分析癌癥病人羰基化合物標志物，將衍生試劑先溶入萃取試劑，使得衍生反應在液滴溶劑內(nèi)發(fā)生，試驗結(jié)果論證該方法的重現(xiàn)性、回收率更加良好。(3)靜態(tài)頂空液滴微萃取與動態(tài)頂空液滴微萃取分析技術比較，理論預測動態(tài)萃取方法的相相接觸更為完全，萃取效率更好，但是試驗論證由于操作的難度較大，動態(tài)過程中液滴溶劑容易損失，該方法檢測限確實降低，但是重現(xiàn)性比較差?？傮w而言，對于重大疾病的生物標志物分析，固相微萃取和液

10、滴微萃取都可以很好的達到分析目的，可根據(jù)實際情況進行選擇。
　　 第四章主要針對幾類重要的新生兒有機酸尿癥的信號物質(zhì)進行研究分析。由于我國目前醫(yī)療水平還未達到發(fā)達國家水平，新生兒有機酸尿癥的胎檢以及出生篩查基本屬于空白。然而遺傳性有機酸尿癥在早期基本沒有明顯病癥，患者在生長過程中會伴隨著發(fā)育緩慢、腦發(fā)育不健全、神經(jīng)性疾病等一系列復雜病癥，因而對于有機酸尿癥研究發(fā)展適合新生兒篩查的新技術新方法勢在必行。本章通過尋找合適的衍生試劑，