液相色譜分析方法的建立

1、一.方法建立的步驟方法建立的步驟二開始前應(yīng)知道二開始前應(yīng)知道1.樣品的性質(zhì)樣品的性質(zhì)在開始方法建立之前，我們應(yīng)該檢查自己對樣品的了解程度，并明確分離在開始方法建立之前，我們應(yīng)該檢查自己對樣品的了解程度，并明確分離目標(biāo)。目標(biāo)。表1有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息有關(guān)樣品組分和性質(zhì)的重要信息所含化合物的數(shù)目化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光譜圖化合物在樣品中的濃度范圍樣品的溶解度樣品的化學(xué)成分能夠為選擇HPL

2、C分離的最佳初始條件提供有價值的線索根據(jù)已知的樣品信息，HPLC方法建立有兩種不甚相同的模式。一種模式依據(jù)樣品的“化學(xué)性質(zhì)”選擇最佳初始條件，色譜工作者需很大程度依賴于過去的經(jīng)驗（如類似結(jié)構(gòu)化合物的分離）和或用文獻(xiàn)資料補充現(xiàn)有信息而另一種模式則直接開始色譜分離，而對樣品的性質(zhì)不大注意這兩種HPLC的方法建立模式可分別稱為理淪型與經(jīng)驗型初始分離一旦開始，可以根據(jù)類似的思路（理論的與經(jīng)驗的）選擇進(jìn)一步的實驗。2.分離的目的分離的目的HPLC

3、分離的目的必須十分明確，下面的問題在建立方法之初就應(yīng)確定：（1）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時做？；（2）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測定結(jié)果更加可靠，但卻沒必要將它們彼此完全分開。（3）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度通常能達(dá)到1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況。（4）特殊化合物可能會以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，

4、環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？（5）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時處理大量樣品時，運行時間將變得非常重要。有時甚至為了縮短運行時間而以犧牲樣品分離度作代價，如縮短柱長或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過10個，運行時間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)。（6）將要使用該方法的實驗室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計與生產(chǎn)的設(shè)備上運行？方法建立實驗開始

5、之前，應(yīng)明確對方法的這些要求。方法建立實驗開始之前，應(yīng)明確對方法的這些要求。三.樣品的預(yù)處理和檢測樣品的預(yù)處理和檢測等度肽類糖類梯度大分子大分子蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)離子對離子對核酸糖類正相合成聚合物合成聚合物圖1.利用樣品的有關(guān)條件，選擇初始實驗分離條件利用樣品的有關(guān)條件，選擇初始實驗分離條件表2特殊樣品的處理特殊樣品的處理樣品要求無機離子檢測為主要問題；使用離子色譜異構(gòu)體有些異構(gòu)體能用反相HPLC分開，可分為一般樣品類中；用(I)正相HPLC

6、或(2)環(huán)糊精—硅膠色譜柱的反相分離能較好地分離異構(gòu)體對映體分離這些化合物需要“手性”條件生物樣品多種因素如分子構(gòu)象，極性官能團和寬范圍的疏水性使這種樣品很特殊大分子“大”分子需要大孔徑的色譜柱填料(≥10.m孔徑)表3首次首次HPLC分離的較好實驗條件分離的較好實驗條件分離條件較好的首要選擇色譜柱色譜柱尺寸(長度內(nèi)徑ID)粒度固定相15ⅹ4.6cn5uma.C8或C18流動相流動相溶劑A和B緩沖液—乙睛%B80—100%b.緩沖液(化

7、合物、pH、濃度)25mM磷酸鉀，2.0＜pH＜3.0c.添加劑(如胺改性劑、離子對試劑)開始時不用流速流速0.5—2.0mlmin溫度溫度35—45℃樣品大小樣品大小體積重量d.＜25ul＜100ug備注：a.3.5um微粒為另一選擇；b.用于初始等度分離；初始用梯度實驗較好；c.中性樣品不需要緩沖液；d.小體積色譜柱（如7.50.46cm3.5um）需要的量更小。表4主要主要HPLC方法的特性方法的特性方法特點色譜柱何時應(yīng)該使用該方