生物樣品自動化在線固相萃取—高效液相色譜分析方法學研究.pdf

1、在現(xiàn)代體內(nèi)藥物分析工作中，80％左右的工作量及研究經(jīng)費用于生物樣品的前處理及分析樣品制備等步驟。本文基于在線固相萃取前處理技術，實現(xiàn)了樣品前處理的自動化，建立了系列“準確、靈敏、高通量”的分析方法，為體內(nèi)藥物監(jiān)測及藥代動力學研究提供有力的技術支持。
　　首先，本研究探討了全自動在線固相萃取-高效液相法用于測定小鼠血漿中補骨脂二氫黃酮甲醚的濃度。本方法簡化了血漿樣品繁瑣的前處理步驟，提高了分析的速度及效率，實現(xiàn)了對目標化合物的較高回

2、收率。本研究采用的CapcellMF Ph-1柱可有效去除血漿樣品中的基質(zhì)，且對補骨脂二氫黃酮甲醚的富集效果較好;在小鼠血漿中補骨脂二氫黃酮甲醚濃度測定過程中，最低定量限可低至20ng/ml，其選擇性、線性、精密度、準確度及回收率均較好。補骨脂二氫黃酮甲醚在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)為吸收較快、清除較快、生物利用度較低的藥代動力學特征。
　　在線固相萃取-高效液相生物分析方法的多參數(shù)優(yōu)化是方法學建立中的至關重要的步驟。本論文應用響應面分析法(R

3、SM)對影響在線固相萃取過程中的若干因素進行了系統(tǒng)優(yōu)化;按照影響程度由大到小依次為:洗脫劑pH值(pH)＞轉(zhuǎn)移時間(t(T))＞基質(zhì)洗脫時間(t(M))＞洗脫劑流速(F);該方法得到的最優(yōu)條件組合大大提高了分析結(jié)果的準確性與可靠性。在響應面優(yōu)化的基礎上建立的在線固相萃取-高效液相色譜分析法能夠快速、準確的測定小鼠血漿中高活性生物堿WM-5的濃度，整個分析時間8 min; WM-5的最低定量限為20 ng/ml。本方法簡化了血漿樣品繁瑣的

4、前處理步驟，實現(xiàn)了全自動化生物分析過程，提高了分析的速度及效率。
　　在上述“準確、高效、快速”的單個目標分析物的分析方法基礎上，本文針對臨床應用最多的、具有不同理化參數(shù)的系列心血管類藥物，系統(tǒng)地探討了在線固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)方法學的適應性?；谛难茴愃幬镂锢砘瘜W參數(shù)的差異（如分子量，logP，pKa等），本文系統(tǒng)考察了不同在線固相萃取柱的提取效率及相應的色譜分析與質(zhì)譜參數(shù)，并進行了條件優(yōu)化。實驗結(jié)果顯示:采用反相

5、LiChrospher(@)RP-18 ADS柱作為在線固相萃取柱，可有效實現(xiàn)目標化合物群的保留與分離，且所用的分析條件溫和(pH9.5醋酸銨緩沖液上樣，pH3.5醋酸銨緩沖液洗脫），避免了血漿中蛋白的沉淀現(xiàn)象;經(jīng)反沖后，對分析柱系統(tǒng)進行梯度洗脫，可有效實現(xiàn)10個不同極性的心血管類藥物的同步色譜分離;整個分析時間11min，未見內(nèi)源性基質(zhì)與其他物質(zhì)的干擾;其最低定量限、精確度、準確度、回收率與基質(zhì)效應均優(yōu)于文獻報道的普通液相色譜分析結(jié)果

6、。
　　最后，本文利用在線固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)對當前藥物分析領域中一類較難分析的化合物-核苷類抗病毒藥物進行了方法學的系統(tǒng)研究。由于此類化合物的極性極大、水溶性好，其藥代動力學研究存在多種困難，特別是樣品前處理過程中的基質(zhì)去除、目標分析物的有效提取等。針對臨床治療艾滋病的“雞尾酒”處方中常用的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（齊多夫定、拉米夫定、去羥肌苷、恩曲他濱），建立了高效的在線固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng):以混合

7、型陽離子交換柱Oasis(@) MCX為在線固相萃取柱，優(yōu)化了流動相系統(tǒng)、固相萃取系統(tǒng)與分析系統(tǒng)，實現(xiàn)四個化合物有效保留與色譜分離;整個分析時間10min，未見內(nèi)源性基質(zhì)與其他物質(zhì)的干擾;其最低定量限、精確度、準確度、回收率與基質(zhì)效應均滿足FDA對生物樣本分析的要求。同時，針對抗病毒治療藥物-利巴韋林及其前藥Taribavirin，本文建立了一種新型的在線固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法:自主設計了基于半化學吸附的在線固相萃取柱-苯