極性脂質(zhì)的質(zhì)譜分析方法研究及其應(yīng)用.pdf

1、本文主要分為四部分:第一部分建立了電噴霧串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜的直接進(jìn)樣方法，分析樣品中的六類磷脂和硫苷脂的分子種亞類組成;第二部分建立了高效液相色譜和電噴霧串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用方法，分析樣品中神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺的分子種亞類組成;第三部分將直接進(jìn)樣分析方法和液質(zhì)聯(lián)用分析方法結(jié)合在一起，設(shè)計自制進(jìn)樣裝置及進(jìn)樣程序，實現(xiàn)極性脂質(zhì)的同時在線分析;第四部分將三文魚油通過生物酶法轉(zhuǎn)酯化結(jié)合到大豆卵磷脂上，合成出含有豐富多

2、烯磷脂的新型大豆卵磷脂，利用已建立的極性脂質(zhì)在線同時分析方法，分析比較改性前后大豆卵磷脂的分子種差異。最終將新型大豆卵磷脂應(yīng)用到脂質(zhì)體的制備中，包裹膠原蛋白，形成脂質(zhì)體。
　　首先，本文建立了電噴霧串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜直接進(jìn)樣方法，對六類磷脂（磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸和磷脂酰甘油）和硫苷脂的分子種亞類組成進(jìn)行測定。以鼠腦為樣本，先利用氯仿/甲醇法提取樣品中的脂質(zhì)，后利用固相萃取小柱富集、純化極性脂質(zhì)

3、。樣品導(dǎo)入離子源后，在相應(yīng)的母離子和中性丟失掃描模式下實現(xiàn)一次進(jìn)樣檢測分析六類磷脂和硫苷脂的目的。經(jīng)驗證，該方法的提取回收率(82.6％-104.2％)、日間精密度(1.44-3.87)、日內(nèi)精密度(2.74-5.87)、最低檢出限(0.50-0.87 ng/ml)和最低定量限(1.5-2.6 ng/ml)能夠滿足復(fù)雜生物樣本中磷脂和硫苷脂的分析要求。
　　其次，本文建立了高效液相色譜和電噴霧串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用的方法，對神經(jīng)酰

4、胺、鞘磷脂、葡萄糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺的分子種亞類組成進(jìn)行測定。分析標(biāo)準(zhǔn)品在碰撞誘導(dǎo)活化解離過程中的特征性碎片離子，建立相應(yīng)的母離子/子離子對數(shù)據(jù)庫。以鼠腦為樣本，先利用氯仿/甲醇法提取樣品中的脂質(zhì)，后利用固相萃取小柱富集、純化極性脂質(zhì)，將樣品注入高效液相色譜系統(tǒng)，對神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺進(jìn)行分離，洗脫物進(jìn)入質(zhì)譜，在多反應(yīng)監(jiān)測模式的多個時間窗口下，利用已建立的母離子/子離子對實現(xiàn)四種鞘脂分子種的快速實時監(jiān)測。經(jīng)

5、驗證，該方法的提取回收率(81.5％-104.5％)、日間精密度(1.12-2.25)、日內(nèi)精密度(2.42-3.81)、最低檢出限(0.03-0.08 ng/ml)和最低定量限(0.10-0.25ng/ml)能夠滿足復(fù)雜生物樣本中鞘脂的分析要求。
　　其后，本文將直接進(jìn)樣分析方法和液質(zhì)聯(lián)用分析方法結(jié)合在一起，建立了一種極性脂質(zhì)的在線同時分析方法。設(shè)計以針泵注射器、六通閥和三通閥為主體的自動進(jìn)樣裝置，先利用針泵注射器將樣品直接導(dǎo)入

6、離子源中，在特異性的母離子和中性丟失模式下，完成對六類磷脂和硫苷脂的掃描分析，再將樣品導(dǎo)入六通閥的定量環(huán)中，最后將一定體積的樣品注入液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，經(jīng)液相分離后，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下完成對神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺的檢測分析。該方法能在40分鐘內(nèi)完成11種極性脂質(zhì)（300種以上分子種）快速、準(zhǔn)確的同時在線分析。本文應(yīng)用該方法分析了三種不同動物來源（鼠、鴨、三文魚）腦組織中的極性脂質(zhì)，得到鼠腦中307種，鴨腦中308種和三

7、文魚腦中324種極性脂質(zhì)分子種信息。比較可得，不同動物來源的磷脂差異顯著，特別是三文魚腦中富含鼠腦和鴨腦所不含的多烯磷脂;不同動物來源的鞘脂差異主要表現(xiàn)在含量上，基本的分子種總類相似。
　　最后，本文從三文魚加工副產(chǎn)品中提取魚油，利用尿素包合法富集多不飽和脂肪酸，以生物酶法轉(zhuǎn)酯化將其結(jié)合到大豆卵磷脂上，形成富含多烯磷脂的新型大豆卵磷脂。設(shè)計正交實驗，以改性后大豆磷脂中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸（DHA）的得率為指標(biāo)，

8、得到最佳合成條件:大豆卵磷脂和魚油的比例為1∶8，磷脂酶的添加量為18％，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間為18h，體系中的水分含量為4％。在最佳條件下，大豆卵磷脂的EPA和DHA得率為24.13％。利用已建立的極性脂質(zhì)在線分析方法，分析改性前后大豆卵磷脂的分子種組成差異，得出大豆卵磷脂中主要成分為磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸。改性后大豆卵磷脂與前者最大的區(qū)別為多烯磷脂分子種的增加和溶血性磷脂含量的上升。改性前大豆卵磷脂

9、的不飽和度較低，最主要的磷脂分子種為PL34∶2，PL36∶4和PL36∶3。經(jīng)過磷脂酶改性后，大豆卵磷脂新增了許多多烯磷脂分子種，占到總量的27.41-37.01％。改性前大豆卵磷脂中溶血性磷脂含量較低(3.52-4.57％)，改性后大豆卵磷脂的溶血性磷脂含量增加(26.85-36.01％)。為了延長改性大豆卵磷脂的貨架期，本研究考察了不同抗氧化劑對其氧化穩(wěn)定性的影響，得出2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為最佳抗氧化劑，添加0