質(zhì)譜分析外源性和內(nèi)源性寡糖的方法學(xué)研究.pdf

1、本論文應(yīng)用質(zhì)譜法建立了外源性和內(nèi)源性寡糖微量分析的方法和策略。首先，應(yīng)用ESI-CID-MS／MS對外源性系列褐藻酸寡糖進行了序列分析，根據(jù)褐藻酸寡糖所產(chǎn)生的跨環(huán)斷裂碎片的不同可以區(qū)分甘露糖醛酸和古羅糖醛酸殘基在糖鏈中的位置，從而確定寡糖的序列。另一方面，應(yīng)用ESI-MS對內(nèi)源性糖鏈微量分析進行了研究，主要是對糖蛋白上O，N-糖鏈釋放方法進行探索以及對所釋放寡糖本身進行描述和比較進行了初步的研究。 本文第一部分應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)建立

2、了褐藻酸寡糖微量序列分析方法。首先以聚甘露糖醛酸、聚古羅糖醛酸和褐藻酸為原料應(yīng)用弱酸降解和酶解得到均一甘露糖醛酸和古羅糖醛酸寡糖以及甘露糖醛酸古羅糖醛酸鑲嵌片段寡糖。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用ES-CID-MS／MS結(jié)合NMR技術(shù)對所得褐藻酸寡糖的序列進行分析，建立質(zhì)譜法分析褐藻酸寡糖序列的方法。應(yīng)用所建立的質(zhì)譜學(xué)方法對來源于Vibriosp．WYA褐藻膠裂合酶的降解特性進行了分析。結(jié)果表明，利用甘露糖醛酸和古羅糖醛酸構(gòu)型不同在質(zhì)譜中產(chǎn)生的斷裂碎

3、片不同可對其序列進行分析，在MS／MS條件下甘露糖醛酸和古羅糖醛酸這兩種異構(gòu)體得到了有效的區(qū)分，從而確定對寡糖進行序列分析的方法是可行的，在相同的質(zhì)譜條件下，中間糖環(huán)甘露糖醛酸殘基出現(xiàn)了一個新的脫羧碎片，還原端甘露糖醛酸和古羅糖醛酸殘基的跨環(huán)斷裂碎片的強度比例不同，由此結(jié)果可以得出褐藻酸寡糖的序列，而且NMR結(jié)果與MS／MS結(jié)果相互佐證。所以本文建立了有效的外源性微量糖鏈(褐藻膠寡糖)的分析方法。所建立的方法除了可以對NMR無法得到精確

4、結(jié)果的較大聚合度寡糖進行解析外，同時也可使樣品的用量從毫克級降到了皮克級。并應(yīng)用所建立方法分析和確定了來源于Vibrio sp．WYA褐藻膠裂合酶的降解特性。 本文第二部分應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)建立了對糖蛋白中O-和N-糖鏈的釋放和分析策略和方法。對于O-糖鏈釋放方法，首先確定研究對象為不同特性的。BSM(MucinⅠ)，PSM(Mucin Ⅱ)和Fetuin。應(yīng)用Carlson方法(β-elimination)釋放其O-糖鏈，在這個過

5、程中本文應(yīng)用了硼氫化鈉和氘代硼氫化鈉對O-糖鏈進行釋放，在質(zhì)譜分析過程中同時將兩個結(jié)果對比確定其準(zhǔn)確性。之后，對新的釋放還原性O(shè)-糖鏈的化學(xué)方法進行探索，應(yīng)用EsI/Ms將其結(jié)果與Carlson方法結(jié)果進行比較，以確定所建立方法的可行性。對于N-糖鏈釋放方法，首先以標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白Fetuin為研究對象，應(yīng)用PNGase F．對其N-糖鏈進行釋放并應(yīng)用ESI／MS對結(jié)果進行分析。之后，對新的釋放還原性N-糖鏈的化學(xué)方法進行探索，以ESI／MS

6、將其結(jié)果與酶解方法結(jié)果進行比較，以確定所建立方法的可行性。結(jié)果顯示，飽和氨水在較低溫度下可以對BSM(Mucin I)，PSM(Mucin Ⅲ)和Fetuin上O-糖鏈進行釋放，得到了具有還原性寡糖，并有效的抑制了“Peeling reaction”，同時對Fetuin上的N-糖鏈影響較小，這表明在該條件下可以對O-糖鏈進行有效的較針對性的釋放。對于N-糖鏈的釋放，在無需飽和的氨水條件下，較高溫度便可以釋放N-糖鏈，質(zhì)譜結(jié)果與酶解所得結(jié)