基于親水液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的大鼠血漿中內(nèi)源性糖類和5-羥色胺的定量方法學(xué)研究.pdf

1、隨著代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的疾病標(biāo)志物，對(duì)這些標(biāo)志物以及代謝途徑上下游的代謝物進(jìn)行深入研究有助于人們揭示疾病的發(fā)生及發(fā)展的機(jī)理、臨床診斷、藥理學(xué)研究等。然而，這些物質(zhì)大多數(shù)為極性小分子，在實(shí)際分析研究中存在同分異構(gòu)多、待測(cè)物含量低、雜質(zhì)干擾多、無(wú)與之相對(duì)應(yīng)的空白基質(zhì)等一系列亟待解決的問題。目前親水色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）及其與液質(zhì)（liquid chro

2、matography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，為這些極性化合物的分離、分析提供了新手段。在對(duì)生物樣品如血清、血漿和尿液的代謝輪廓研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性糖類物質(zhì)通常作為差異物出現(xiàn)在不同疾病中；在神經(jīng)傳遞過程中，5-羥色胺起著重要的作用，常有報(bào)道稱，5-羥色胺失調(diào)現(xiàn)象出現(xiàn)在各種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂和精神疾病包括抑郁、焦慮、精神分裂癥的研究中。
　　本論文基于親水色譜的LC-MS/M

3、S體系對(duì)生物基質(zhì)中的兩類極性小分子物質(zhì)，內(nèi)源性糖類和內(nèi)源性5-羥色胺，進(jìn)行研究，其內(nèi)容包括：
　　1）系統(tǒng)考察色譜柱、流動(dòng)相組成、柱溫對(duì)糖類物質(zhì)的保留與分離行為的影響，簡(jiǎn)單研究糖類物質(zhì)在HILIC amide色譜柱上的保留機(jī)制；尋找合適的內(nèi)源性替代基質(zhì)；對(duì)蛋白沉淀溶劑體系進(jìn)行優(yōu)化；按要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；最后對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明：采用冷的甲醇/乙腈(v/v,50/50)沉淀，渦旋1 min，并于-20℃放置20 min后

4、再離心沉淀的前處理方式最佳；方法驗(yàn)證中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和穩(wěn)定性的考察結(jié)果表明該方法符合內(nèi)源性物質(zhì)血漿樣品的分析要求。
　　2）系統(tǒng)考察色譜柱、流動(dòng)相組成、柱溫對(duì)5-羥色胺的保留與分離行為的影響，簡(jiǎn)單研究該物質(zhì)在HILIC amide色譜柱上保留機(jī)制；尋找合適的內(nèi)源性替代基質(zhì)；對(duì)蛋白沉淀溶劑體系進(jìn)行優(yōu)化；按要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；最后對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明：采用冷的甲醇/乙腈(v/v,50/50)沉淀，渦旋

5、1 min，并于-20℃放置20 min后再離心沉淀的前處理方式最佳；方法驗(yàn)證中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和穩(wěn)定性的考察結(jié)果表明該方法符合內(nèi)源性物質(zhì)血漿樣品的分析要求。
　　本研究針對(duì)16個(gè)碳水化合物及5-羥色胺分別建立的兩個(gè)親水色譜的UHPLC-MS/MS方法，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。特別是糖類物質(zhì)的分析方法的建立彌補(bǔ)了目前對(duì)糖類物質(zhì)分析研究的不足。另外，建立方法過程中對(duì)化合物在HILIC amide色譜柱上