基于液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定內(nèi)源性激素的方法研究.pdf

1、內(nèi)源性激素主要包括四大類:皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素和孕激素。這些激素在體內(nèi)通過不同的酶相互轉(zhuǎn)化，作用到人體各個神經(jīng)和組織，然后通過調(diào)節(jié)各種組織細(xì)胞的代謝活動來影響人體的生理活動，其濃度的異常變化也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，所以，近幾年來，內(nèi)源性激素的測定一直是體內(nèi)藥物分析研究的熱點(diǎn)，建立高靈敏度和高專屬性的分析方法，準(zhǔn)確測定內(nèi)源性激素含量，探索人類機(jī)體調(diào)控機(jī)能和疾病的發(fā)病機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供依據(jù)。
　　在本課題中，我們

2、選擇了臨床應(yīng)用較多且具有代表性的11種內(nèi)源性激素或其代謝產(chǎn)物作為研究對象，其中包括皮質(zhì)激素（可的松、氫化可的松、四氫化可的松、氫化四氫化可的松、allo-氫化四氫化可的松）、雌激素（雌二醇）、雄激素（睪酮、二氫睪酮、脫氫表雄酮）和孕激素（孕酮、17α-羥基孕酮），建立不同的分析方法測定人血漿和尿液中內(nèi)源性激素的含量。這11種激素與體內(nèi)的某些代謝酶活性及人體生長發(fā)育、臨床常見疾病關(guān)系尤為密切。例如，孕酮在胚胎發(fā)育等發(fā)面具有重要作用;雌二醇

3、與弱視失明、骨質(zhì)疏松等疾病有關(guān);可的松和氫化可的松通過11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSD)相互轉(zhuǎn)化，而11β-HSD與糖尿病、認(rèn)知功能及胚胎發(fā)育有關(guān)，因此測定兩種激素及其代謝產(chǎn)物的濃度比值可考察此種酶的活性水平，進(jìn)而為臨床某些疾病的治療和診斷提供參考。
　　本文共分三章。在第一章中，我們選擇較為簡單的高效液相色譜法測定9種內(nèi)源性激素，并將該方法用于實(shí)際生物樣品中內(nèi)源性激素的測定。在前處理方面，采用固相萃取法，由于四氫化可的松和

4、氫化四氫化可的松在尿樣中以綴合物的形式存在，所以尿樣需經(jīng)葡萄糖醛酸酶水解后再固相萃取。在波長選擇方面，因?yàn)樗臍浠傻乃?、氫化四氫化可的松、allo-氫化四氫化可的松結(jié)構(gòu)中沒有共軛體系，17β-雌二醇濃度水平低（205nm吸收強(qiáng)），這四種組分選用205nm作為檢測波長;可的松、氫化可的松、睪酮、孕酮、17α-羥基孕酮含有不飽和酮基，在245nm波長處靈敏度最高，故實(shí)驗(yàn)選用205nm和245nm兩個波長同時檢測9種內(nèi)源性激素。血樣及尿樣經(jīng)系

5、統(tǒng)方法學(xué)考察，雖然方法具有較強(qiáng)的專屬性和較高的靈敏度，但是在實(shí)際生物樣品分析中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性物質(zhì)仍然存在較大干擾，方法可滿足外源性激素的測定要求，但無法滿足內(nèi)源性激素的測定要求。所以，在第二章中，我們建立了靈敏度相對更高、專屬性更強(qiáng)的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對內(nèi)源性激素進(jìn)行分析測定，色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法的靈敏度和分析速度都有明顯提高，但影響因素也較多，睪酮和孕酮等無法被準(zhǔn)確測定。
　　在第三章中，我們以地塞米松為內(nèi)標(biāo)，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

6、測定9種內(nèi)源性激素的方法（可的松、氫化可的松、四氫化可的松、allo-/氫化四氫化可的松、雌二醇、睪酮、孕酮、17α-羥基孕酮）。生物樣品前處理分別比較了蛋白沉淀法、液液提取法和固相萃取法三種方法，考察基質(zhì)效應(yīng)和回收率，發(fā)現(xiàn)固相萃取基質(zhì)效應(yīng)較小、回收率較高，所以生物樣品前處理采用固相萃取法進(jìn)行。在色譜質(zhì)譜優(yōu)化方面，我們考察了正離子和負(fù)離子兩種模式下，被測組分離子化情況，發(fā)現(xiàn)正離子模式下，背景和雜質(zhì)信號干擾較少，被測組分離子化效率更穩(wěn)定，

7、而且在流動相中加入0.1％甲酸可以明顯增強(qiáng)離子響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)考察了方法的專屬性、靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)、線性、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，結(jié)果顯示該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高。將該方法應(yīng)用于胎兒發(fā)育遲緩的孕婦尿樣和胎兒臍血及胎兒正常發(fā)育的孕婦尿樣和胎兒臍血中內(nèi)源性激素測定，結(jié)果顯示胎兒發(fā)育遲緩的孕婦體內(nèi)氫化可的松/可的松的濃度比值、氫化四氫化可的松/四氫化可的松的濃度比值均高于對照組，且孕婦體內(nèi)雌激素和孕激素濃度較正常女性體內(nèi)的濃度偏高，雄性激素濃度較正