基于液相色譜及液質聯用技術測定內源性激素的方法研究.pdf

1、內源性激素主要包括四大類:皮質激素、雌激素、雄激素和孕激素。這些激素在體內通過不同的酶相互轉化，作用到人體各個神經和組織，然后通過調節(jié)各種組織細胞的代謝活動來影響人體的生理活動，其濃度的異常變化也與某些疾病的發(fā)病機制密切相關，所以，近幾年來，內源性激素的測定一直是體內藥物分析研究的熱點，建立高靈敏度和高專屬性的分析方法，準確測定內源性激素含量，探索人類機體調控機能和疾病的發(fā)病機制，為疾病的診斷和治療提供依據。
　　在本課題中，我們

2、選擇了臨床應用較多且具有代表性的11種內源性激素或其代謝產物作為研究對象，其中包括皮質激素（可的松、氫化可的松、四氫化可的松、氫化四氫化可的松、allo-氫化四氫化可的松）、雌激素（雌二醇）、雄激素（睪酮、二氫睪酮、脫氫表雄酮）和孕激素（孕酮、17α-羥基孕酮），建立不同的分析方法測定人血漿和尿液中內源性激素的含量。這11種激素與體內的某些代謝酶活性及人體生長發(fā)育、臨床常見疾病關系尤為密切。例如，孕酮在胚胎發(fā)育等發(fā)面具有重要作用;雌二醇

3、與弱視失明、骨質疏松等疾病有關;可的松和氫化可的松通過11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSD)相互轉化，而11β-HSD與糖尿病、認知功能及胚胎發(fā)育有關，因此測定兩種激素及其代謝產物的濃度比值可考察此種酶的活性水平，進而為臨床某些疾病的治療和診斷提供參考。
　　本文共分三章。在第一章中，我們選擇較為簡單的高效液相色譜法測定9種內源性激素，并將該方法用于實際生物樣品中內源性激素的測定。在前處理方面，采用固相萃取法，由于四氫化可的松和

4、氫化四氫化可的松在尿樣中以綴合物的形式存在，所以尿樣需經葡萄糖醛酸酶水解后再固相萃取。在波長選擇方面，因為四氫化可的松、氫化四氫化可的松、allo-氫化四氫化可的松結構中沒有共軛體系，17β-雌二醇濃度水平低（205nm吸收強），這四種組分選用205nm作為檢測波長;可的松、氫化可的松、睪酮、孕酮、17α-羥基孕酮含有不飽和酮基，在245nm波長處靈敏度最高，故實驗選用205nm和245nm兩個波長同時檢測9種內源性激素。血樣及尿樣經系

5、統(tǒng)方法學考察，雖然方法具有較強的專屬性和較高的靈敏度，但是在實際生物樣品分析中發(fā)現，內源性物質仍然存在較大干擾，方法可滿足外源性激素的測定要求，但無法滿足內源性激素的測定要求。所以，在第二章中，我們建立了靈敏度相對更高、專屬性更強的液相色譜質譜聯用法對內源性激素進行分析測定，色譜質譜聯用方法的靈敏度和分析速度都有明顯提高，但影響因素也較多，睪酮和孕酮等無法被準確測定。
　　在第三章中，我們以地塞米松為內標，建立了液相色譜-串聯質譜

6、測定9種內源性激素的方法（可的松、氫化可的松、四氫化可的松、allo-/氫化四氫化可的松、雌二醇、睪酮、孕酮、17α-羥基孕酮）。生物樣品前處理分別比較了蛋白沉淀法、液液提取法和固相萃取法三種方法，考察基質效應和回收率，發(fā)現固相萃取基質效應較小、回收率較高，所以生物樣品前處理采用固相萃取法進行。在色譜質譜優(yōu)化方面，我們考察了正離子和負離子兩種模式下，被測組分離子化情況，發(fā)現正離子模式下，背景和雜質信號干擾較少，被測組分離子化效率更穩(wěn)定，

7、而且在流動相中加入0.1％甲酸可以明顯增強離子響應。實驗考察了方法的專屬性、靈敏度、基質效應、線性、精密度、準確度和穩(wěn)定性，結果顯示該方法專屬性強、靈敏度高。將該方法應用于胎兒發(fā)育遲緩的孕婦尿樣和胎兒臍血及胎兒正常發(fā)育的孕婦尿樣和胎兒臍血中內源性激素測定，結果顯示胎兒發(fā)育遲緩的孕婦體內氫化可的松/可的松的濃度比值、氫化四氫化可的松/四氫化可的松的濃度比值均高于對照組，且孕婦體內雌激素和孕激素濃度較正常女性體內的濃度偏高，雄性激素濃度較正