馬兜鈴酸類物質(zhì)的液相色譜聯(lián)用技術(shù)及應(yīng)用.pdf

1、馬兜鈴酸類物質(zhì)，包括馬兜鈴酸(aristolochic acids，AAs)和馬兜鈴內(nèi)酰胺(aristolactams，ALs)，已經(jīng)被證實具有腎毒性、致癌和致基因突變作用，含馬兜鈴酸類物質(zhì)的藥用植物和制劑因此被多數(shù)國家禁用。我國也先后取消了關(guān)木通、廣防己和青木香的藥用標(biāo)準(zhǔn)，并對含馬兜鈴、尋骨風(fēng)、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑嚴(yán)格按處方藥管理。但是，仍有一些馬兜鈴酸類物質(zhì)含量較低的中藥或植物藥在使用。因此，為保證用藥安全，應(yīng)該加強藥品生產(chǎn)、流

2、通和使用各環(huán)節(jié)的監(jiān)管。 中醫(yī)對中藥毒性的認(rèn)識由來已久，在長期的實踐中，中醫(yī)藥發(fā)展和形成了一系列減毒增效的理論和技術(shù)。已經(jīng)有研究證實，炮制和配伍能夠降低關(guān)木通和廣防己等中藥的毒性。我們應(yīng)該正確認(rèn)識馬兜鈴酸類物質(zhì)的毒性作用，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，積極開展含馬兜鈴酸類物質(zhì)中草藥的實驗研究，尋找減毒制毒的規(guī)律和途徑，發(fā)揮其正常的藥用療效，減輕“馬兜鈴酸事件”所帶來的負(fù)面影響。本文首先介紹了藥用植物及其制劑中馬兜鈴酸類物質(zhì)的一系列液相色譜聯(lián)

3、用檢測技術(shù)。然后，基于所開發(fā)的色譜檢測平臺，我們對馬兜鈴酸Ⅰ的細(xì)胞毒性、細(xì)胞毒代動力學(xué)進(jìn)行了初步探討，并建立了關(guān)木通配伍過程的成分分析方法，以此從化學(xué)角度來研究配伍減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。 具體研究工作如下： 1．為滿足藥用植物及其制劑中馬兜鈴酸類物質(zhì)的篩查需求，我們開發(fā)了一個面向最普及的儀器設(shè)備和簡單的分析環(huán)境的高效液相色譜方法。通過對提取、分離和分析條件的優(yōu)化，我們成功地對12種藥用植物和兩種制劑中的9個馬兜鈴酸類物質(zhì)進(jìn)行了

4、同時分析。該法以甲醇—0.2％HAc為流動相進(jìn)行梯度洗脫，各種馬兜鈴酸類物質(zhì)獲得了良好的色譜分離。分析方法的線性范圍約為2個數(shù)量級，在所研究的濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)超過0.9950。日內(nèi)精密度和日間精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.35％。平均回收率落在88.4—98.8％之間。這些結(jié)果表明本法準(zhǔn)確可靠。相比于先前的文獻(xiàn)方法，本實驗提出的多組分分析方法在對可疑藥品中的馬兜鈴酸類物質(zhì)的篩查和定量分析上具有明顯的優(yōu)勢，更有效，更實用。

5、 2．馬兜鈴酸類物質(zhì)是弱極性的小分子化合物，在電噴霧質(zhì)譜(electro—sprayionization/mass spectrometry，ESI/MS)中的離子化效率不高，易受離子抑制效應(yīng)的影響。通過對基質(zhì)效應(yīng)、離子化模式和錐孔電壓的影響等因素的研究，我們系統(tǒng)探討了馬兜鈴酸類物質(zhì)在ESI質(zhì)譜中的離子化行為，找到了它們的ESI質(zhì)譜裂解規(guī)律，第一次系統(tǒng)闡述了各種馬兜鈴酸類物質(zhì)的離子化機理。在此基礎(chǔ)上，通過對實驗條件和儀器參數(shù)的優(yōu)化，降

6、低了離子抑制效應(yīng)，獲得了比文獻(xiàn)稍高的檢測靈敏度。所開發(fā)的HPLC—DAD—ESI/MS方法可以同時得到每個色譜峰的保留時間、紫外光譜圖、相對分子量和質(zhì)譜特征碎片，因而擁有良好的定性能力。我們將該方法應(yīng)用于9種馬兜鈴科植物和兩個制劑中9個馬兜鈴酸類物質(zhì)的同時分析，結(jié)果令人滿意。 3．為進(jìn)一步提高馬兜鈴酸類物質(zhì)的分析靈敏度，我們引入了熒光檢測。根據(jù)兩大類馬兜鈴酸類物質(zhì)(AAs和ALs)的紫外、熒光特性和它們在馬兜鈴科植物中的分布特征

7、(相對高含量的AAs和痕量的ALs)，我們將DAD和FLD(fluorescence detection，F(xiàn)LD)串聯(lián)使用，巧妙地實現(xiàn)了對多數(shù)樣品中AAs和ALs的直接分析。當(dāng)分析痕量的AAs時，我們提出了一個簡單的衍生方法，即在酸性條件下，將AAs的硝基還原成亞氨基而變成相應(yīng)的ALs再進(jìn)行分析，因而也實現(xiàn)了對AAs的高靈敏分析。對不同樣品的分析結(jié)果表明，DAD和FLD這兩種廉價和普及度廣的檢測器的聯(lián)用與馬兜鈴酸類物質(zhì)在自然界的分布的結(jié)

8、合近于完美。我們將這種HPLC—DAD—FLD聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于各種馬兜鈴科植物及其制劑的分析，結(jié)果表明本法選擇性好，靈敏度高。一般情況下，該法的線性范圍可達(dá)3—4個數(shù)量級，且線性相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.9970；檢測限可低至0.2 ng/ml；日內(nèi)精密度和日間精密度良好，其RSDs小于5.74％：馬兜鈴酸類物質(zhì)的平均回收率為94.5—99.2％。 4．盡管馬兜鈴酸類物質(zhì)的腎毒性已經(jīng)研究得比較深入，但其毒代動力學(xué)方面的數(shù)據(jù)仍很有限。

9、要獲取AA類物質(zhì)的毒理學(xué)或藥理學(xué)數(shù)據(jù)，開發(fā)一個能對生物樣品中AA類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行專一靈敏檢測的分析方法，無疑是很有意義的。馬兜鈴酸(AAs)在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要是相應(yīng)的馬兜鈴內(nèi)酰胺(ALs)衍生物。本文首次采用HPLC—DAD—FLD聯(lián)用檢測技術(shù)對細(xì)胞環(huán)境中的AA I及其代謝產(chǎn)物同時進(jìn)行了靈敏專屬的檢測。本法的線性范圍可達(dá)3個數(shù)量級，且線性相關(guān)系數(shù)大于0.9994。各種細(xì)胞樣品的分析結(jié)果表明了本法具有合適的精密度和靈敏度，適用

10、于細(xì)胞毒代動力學(xué)的研究。基于倒置相差顯微鏡和MTT分析，我們研究了AA I對人正常肝細(xì)胞L—02的細(xì)胞毒性。同時，對細(xì)胞培養(yǎng)液中的AA I及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了色譜分析。實驗檢測到了兩種代謝產(chǎn)物，一種為AL I，另一種也可歸屬為馬兜鈴內(nèi)酰胺衍生物。依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)液中的AA I及其代謝產(chǎn)物的濃度-時間數(shù)據(jù)，進(jìn)行了AAI毒代動力學(xué)參數(shù)的初步統(tǒng)計估測。 5．研究人員已經(jīng)通過動物實驗證實了復(fù)方配伍能夠降低關(guān)木通毒性的事實。為了能從化學(xué)角度研究

11、關(guān)木通配伍過程毒性成分或活性成分的變化情況，我們開發(fā)了一個具有良好定性定量能力的HPLC—DAD—ESI/MS分析方法。我們對關(guān)木通和黃連中的27個組分進(jìn)行了追蹤分析，并對其中7個主要成分進(jìn)行了定量分析。關(guān)木通配伍黃連后，黃連中的原小蘗堿型生物堿的煎出量明顯減少，但關(guān)木通中的馬兜鈴酸類物質(zhì)仍然不可忽略。關(guān)木通配伍大黃的實驗得到了類似結(jié)論。實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)水煎煮能夠明顯降低關(guān)木通中馬兜鈴酸類物質(zhì)的溶出率，同70％乙醇提取方法相比，水回流