水稻呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法研究.pdf

1、隨著代謝組學(xué)的興起,人們?cè)絹?lái)越關(guān)注和重視對(duì)低分子量代謝產(chǎn)物的分析。已有研究表明,作為遺傳信息終產(chǎn)物的低分子量代謝產(chǎn)物,尤其是一些極性代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)起到關(guān)鍵作用。呼吸在植物體的整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中處于樞紐地位,其代謝途徑多樣,具體過(guò)程十分復(fù)雜。呼吸作用主要包括糖酵解、戊糖磷酸途徑和三羧酸循環(huán),代謝產(chǎn)物如磷酸糖、有機(jī)酸、腺苷、還原型輔酶等化合物在植物體內(nèi)具有重要的生理作用,通過(guò)分析相關(guān)代謝產(chǎn)物可以更加全面認(rèn)識(shí)植物呼吸。
　　 呼吸相關(guān)

2、代謝產(chǎn)物極性強(qiáng)、親水性強(qiáng)、化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,不能被反相色譜柱保留。目前,常采用的方法有陰離子交換色譜法、反相離子對(duì)色譜法等,盡管這些方法在一定程度上也能夠取得良好的分離效果,但這些分離模式與質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)的兼容性差,且受靈敏度低等因素的限制。此外,現(xiàn)有的方法能檢測(cè)的樣品基質(zhì)多為細(xì)菌、酵母、培養(yǎng)細(xì)胞等簡(jiǎn)單基質(zhì),對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)如植物研究的較少；且大多只能檢測(cè)樣品中幾種或某一類化合物,缺乏針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)條件下呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的比較全面、有效的檢

3、測(cè)方法。
　　 親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC),是一種用來(lái)改善在反相色譜中保留較差的強(qiáng)極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù),且與質(zhì)譜的兼容性好。本論文采用新型親水作用色譜技術(shù)(HILIC),以聚合氨基柱Shodex Asahipak NH2P-504E為固定相,結(jié)合高靈敏、高選擇性的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器,建立了一種高通量的HILIC-MS／MS分析方法,可對(duì)水稻中的29種

4、呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方法的建立,取得了如下主要研究成果:
　　 1.確定了最佳質(zhì)譜條件
　　 通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜全掃描,得到每個(gè)目標(biāo)代謝物的準(zhǔn)分子離子峰,并分別比較各目標(biāo)物在正離子掃描與負(fù)離子掃描兩種掃描模式下,準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)強(qiáng)度,確定了羧酸類、磷酸糖、及AMP、ADP、ATP、cGMP、GTP等腺苷類化合物選擇負(fù)離子模式監(jiān)測(cè),而NAD+、NADH、NADP、NADPH、FAD、乙酰輔酶A、

5、琥珀酰輔酶A等化合物選擇正離子模式監(jiān)測(cè)；再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得出每個(gè)目標(biāo)代謝物的特征子離子,并在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)下進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析。
　　 2.選擇了適用于呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的色譜柱
　　 通過(guò)對(duì)兩性鍵合固定相ZIC-HILIC色譜柱與聚合氨基色譜柱Shodex Asahipak NH2P-504E的比較研究,明確了目標(biāo)代謝物質(zhì)在聚合氨基液相色譜柱上具有更好的保留行為,分離效果更好。
　　 3.明確了p

6、H、緩沖鹽的種類及濃度等色譜條件對(duì)目標(biāo)代謝物分離的影響
　　 通過(guò)流動(dòng)相pH與緩沖鹽試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)pH值與緩沖鹽是影響目標(biāo)化合物保留的兩個(gè)至關(guān)重要的因素。其表現(xiàn)的具體規(guī)律是:隨著pH值與緩沖鹽濃度的增大,流動(dòng)相洗脫能力增強(qiáng),出峰的化合物個(gè)數(shù)增加,靈敏度提高,峰形改善；0～20mM范圍的甲酸銨、乙酸銨,均無(wú)法解決檸檬酸與異檸檬酸的拖尾以及含多個(gè)磷酸根化合物難洗脫的問(wèn)題,15mM的碳酸銨或碳酸氫銨可確保所有目標(biāo)化合物出峰,并成功解決了拖

7、尾、吸附難題；碳酸銨與碳酸氫銨的作用無(wú)明顯差異；緩沖鹽濃度與pH的最佳組合為碳酸銨濃度15mM,pH10.3。
　　 4.確定了提取水稻樣品中呼吸代謝產(chǎn)物的最佳條件
　　 在水稻樣品的提取中,考察了沸水、80％乙腈、(750:200:50,v／v／v)乙腈／水／甲酸、(3:7,v／v)氯仿／乙腈+水等不同提取液的提取效率。結(jié)果表明,(3:7,v／v)氯仿／乙腈+水的提取最好:在選擇提取方式時(shí),考察了超聲提取和振蕩提取對(duì)提

8、取效率的影響,得出振蕩提取方法更為有效。
　　 5.建立了水稻樣品中呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物的測(cè)定方法
　　 確定了標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍、檢測(cè)限、加標(biāo)回收率和精密度等方法學(xué)參數(shù)。29種呼吸相關(guān)代謝產(chǎn)物在0.01～10mg／kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,方法的檢測(cè)限分別為0.001～0.25mg／kg；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于20％,加標(biāo)回收率為63.3～133.5％。
　　 6.用已建立的提取方法