內(nèi)源性雌激素的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、雌激素主要由卵巢、胎盤等組織產(chǎn)生,參與機(jī)體各種生理和病理活動。近幾十年來,雌激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的作用受到廣泛關(guān)注。動物實驗證實,雌激素不僅可以降低大腦中動脈缺血(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)和全腦缺血(Global Cerebral Ischemia,GCI)模型的梗死容積和死亡率[1,2],還可通過增強(qiáng)海馬齒狀回和室管膜下層的神經(jīng)發(fā)

2、生,促進(jìn)小鼠中風(fēng)后的恢復(fù)[3]。流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)前女性卒中發(fā)生率低于男性,而絕經(jīng)后兩者無明顯差異[4,5]。高血清水平雌激素可顯著提高語言工作記憶,而絕經(jīng)后使用雌激素替代可使女性認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病風(fēng)險減少或延緩[6]。目前認(rèn)為,雌激素神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮主要通過調(diào)節(jié)雌激素的合成和雌激素受體（Eestrogen Receptor,ER)的表達(dá)來實現(xiàn)[7],其機(jī)制包括經(jīng)典的基因組信號通路、非基因組信號通路、抗氧化作用和

3、調(diào)節(jié)線粒體功能等[8]。
　　然而,隨著研究的深入,有關(guān)雌激素神經(jīng)保護(hù)作用的經(jīng)典理論不斷受到質(zhì)疑,2003年發(fā)表在JAMA上的臨床研究提示:在老年(平均年齡63歲)高危中風(fēng)患者,雌激素替代療法反而加重了中風(fēng)損傷和認(rèn)知功能障礙,增加了死亡率,并增加乳腺癌和子宮肌瘤的發(fā)生[9,10];女性雌激素對中風(fēng)影響試驗(Women's Estrogen for Stroke Trial,WEST)結(jié)果顯示,在開始的六個月致命性中風(fēng)和所有早期中風(fēng)

4、發(fā)生率都有所增加[10]。雌激素的神經(jīng)損傷作用被認(rèn)為與其促氧化應(yīng)激[11]、促炎癥反應(yīng)[12]和增加興奮性毒性[13]有關(guān)。
　　經(jīng)過近年來的研究和反思,目前,研究者針對雌激素神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)損傷的雙重作用提出了系列學(xué)說,包括關(guān)鍵期假說[14-16]、劑量依賴學(xué)說[17,18]和受體亞型特異性學(xué)說[19-21]。這些學(xué)說的建立可以部分解釋雌激素產(chǎn)生正反兩方面作用的原因。隨著研究的進(jìn)展,有報道指出ER的表達(dá)水平隨生理周期卵巢雌激素水平

5、的波動而變化[22],但這種變化與腦缺血損傷之間的關(guān)系還未見報道。此外,最新報道指出哺乳動物的腦組織也能合成雌激素,其濃度和活性都遠(yuǎn)高于循環(huán)水平[23,24],并在突觸重塑中發(fā)揮著重要作用[25,26]。這些發(fā)現(xiàn)為雌激素的神經(jīng)保護(hù)作用提供了新的思路。本研究將通過制作不同雌激素水平大鼠MCAO模型,探討不同生理周期卵巢雌激素水平的變化對腦缺血損傷的影響及其可能的機(jī)制。并應(yīng)用C57BL/6小鼠的去卵巢(Ovariectomy,OVX)和GC

6、I模型觀察海馬雌激素與循環(huán)雌激素之間的關(guān)系、海馬雌激素的調(diào)控方式以及其在CNS中的作用和機(jī)制。
　　實驗一:不同生理周期卵巢雌激素的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　目的:
　　通過構(gòu)建不同雌激素水平大鼠MCAO模型,觀察不同生理周期卵巢雌激素水平的變化對腦缺血損傷和預(yù)后的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　將100只3月齡雌性SD大鼠分為5組(n=20):發(fā)情前期組(Proestrus,PE組)、間期組(Diest

7、rus,DE組)、OVX組、芳香化酶抑制劑 Letrozole組(Letro組)和ER拮抗劑ICI182,780組(ICI組)。通過放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)檢測血清17β-雌二醇(17β-Estradiol,E2)水平(n=5),采用線栓法制作大鼠MCAO模型(n=15),缺血2h,再灌注24h后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分,通過TTC染色計算腦梗死容積(n=10),尼氏染色統(tǒng)計半暗帶神經(jīng)元存活情況(n=5),免疫印

8、跡法(Western Blot,WB)分析MCAO之前相對半暗帶區(qū)域皮層ERα、β蛋白表達(dá)變化(n=5)。
　　結(jié)果:
　　RIA檢測結(jié)果顯示PE時E2水平最高,DE最低;給予OVX和Letro后,大鼠E2水平明顯降低;MCAO前PE組和DE組大鼠相對半暗帶區(qū)域ERα蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),但高于OVX組、Letro組和ICI組(P<0.05),各組ERβ表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異;MCAO后,PE組和DE組大鼠

9、半暗帶存活神經(jīng)元數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),但較其他三組存活神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05),神經(jīng)功能損傷程度和腦梗死容積相對其他三組也有明顯改善(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　正常大鼠血清E2水平隨生理周期波動,PE時最高,DE時最低,給予OVX和Letro后進(jìn)一步降低。不同生理周期的卵巢E2對腦缺血的損傷無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,都可以改善腦缺血損傷的預(yù)后,而ERα在卵巢E2介導(dǎo)的腦缺血損傷中可能起更關(guān)鍵的作用。

10、　　實驗二:海馬雌激素的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　目的:
　　利用C57BL/6小鼠的OVX和GCI模型觀察海馬雌激素與循環(huán)雌激素之間的關(guān)系、海馬雌激素的調(diào)控方式以及其在CNS中的作用和機(jī)制。
　　方法:
　　100只雌性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為5組(n=20),Control組---不做任何處理;OVX1w+Oil組---OVX1w后,芝麻油替代3w;OVX1w+E2組---OVX1w后,E2替代3w;OVX1

11、0w+Oil組---OVX10w后,芝麻油替代3w;OVX10w+E2組---OVX10w后,E2替代3w。
　　每組動物按實驗要求準(zhǔn)備好之后,進(jìn)行恐懼箱和水迷宮實驗,之后每組取10只做GCI,其中5只24h后制作石蠟切片進(jìn)行凋亡染色,另5只7d后制作冰凍切片進(jìn)行神經(jīng)元存活染色。每組剩余的10只動物,5只取血并取海馬組織檢測E2水平,另5只取海馬進(jìn)行WB和Real-Time PCR,檢測蛋白和mRNA表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果

12、:
　　本實驗證實OVX后小鼠血清和海馬E2水平降低,短期記憶能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損(P<0.05),GCI后凋亡神經(jīng)元數(shù)目也明顯增多(P<0.05),而在OVX后1w進(jìn)行E2替代可以提高循環(huán)和海馬E2水平,明顯改善依賴海馬的學(xué)習(xí)記憶,減輕GCI后的神經(jīng)元凋亡,但在長時間雌激素剝奪(Long-Term Estrogen Deprivation,LTED)動物E2的神經(jīng)保護(hù)作用消失,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是海馬ERα的降解和

13、E2生成減少共同導(dǎo)致的。
　　結(jié)論:
　　本研究與“關(guān)鍵期假說”的觀點(diǎn)一致。E2神經(jīng)保護(hù)作用的喪失不僅與海馬ERα的不可逆降解有關(guān),還涉及海馬E2生成的減少。因為海馬芳香化酶表達(dá)水平在OVX10w小鼠明顯減弱。芳香化酶是E2合成的關(guān)鍵酶,他的減少進(jìn)一步導(dǎo)致海馬E2合成的減少,此作用與ERα的降解協(xié)同,使E2的神經(jīng)保護(hù)作用喪失。
　　小結(jié):
　　本研究證實,不同生理周期的卵巢E2和海馬E2都具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

14、正常大鼠血清E2水平隨生理周期波動,PE時最高,DE時最低,給予OVX和Letro后進(jìn)一步降低。生理周期內(nèi)的卵巢E2都具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用,并能改善腦缺血損傷的預(yù)后,所以在雌性動物的腦缺血損傷實驗中可以忽略生理周期變化對結(jié)果的影響,而ERα在卵巢E2介導(dǎo)的腦缺血損傷中可能起更關(guān)鍵的作用。海馬E2對依賴海馬的學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)元的存活至關(guān)重要,并可與循環(huán)E2相互作用。OVX1w后E2替代可以逆轉(zhuǎn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降以及對GCI的耐受,但L