內(nèi)源性保護蛋白14-3-3γ在神經(jīng)元缺血損傷中的作用及機制.pdf

1、背景：
　　腦卒中是世界第二大致死疾病，其中80％左右為缺血性腦卒中，具有發(fā)病率高、致殘率高、預(yù)后差等特點，對人類健康造成嚴重威脅，但臨床上尚無有效的針對所有細胞類型的腦保護藥物。因此尋找不同細胞類型中內(nèi)源性保護分子并研究其保護機制將為細胞保護藥物的研發(fā)提供線索。14-3-3蛋白家族廣泛存在于真核細胞，在腦組織中含量最高，占可溶性蛋白的1%。哺乳動物真核細胞中14-3-3蛋白家族有β，γ，ε，η，τ，ζ和σ七種不同亞型，其結(jié)構(gòu)高度

2、保守，能與200多種蛋白相互作用參與細胞增殖分化、凋亡代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的生理功能。14-3-3γ曾被認為是腦神經(jīng)元特異性表達蛋白，而本實驗室已證實14-3-3γ在正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中也有表達、受缺血誘導(dǎo)表達增加、通過結(jié)合磷酸化的Bad起到保護作用。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單位，目前14-3-3蛋白在神經(jīng)元中的作用不明確。
　　目的：
　　觀察14-3-3蛋白在缺血條件下神經(jīng)元中不同亞型的表達，并深入探討14-3-3

3、γ亞型的作用及其機制。
　　方法：
　　用大鼠中動脈永久性栓塞及栓塞后再灌注模型，原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元及小鼠成神經(jīng)瘤Ν2a細胞缺氧缺糖處理在體及體外模擬缺血性腦卒中，免疫組織化學、免疫細胞熒光、PCR及Western blot方法觀察14-3-3蛋白不同亞型的表達及14-3-3γ亞型缺血不同時間點的表達變化；采用抑制肽、shRNA敲除及過表達的方法研究14-3-3γ、β-catenin的作用及機制；用免疫共沉淀及細胞能量共轉(zhuǎn)

4、移的方法研究蛋白之間的相互作用。
　　結(jié)果：
　　1.14-3-3蛋白不同亞型在缺血神經(jīng)元中的表達不同。我們選取大鼠中動脈永久性栓塞1小時及栓塞1小時再灌注24小時模型，采用免疫組織化學、免疫細胞熒光及實時定量 PCR的方法證實缺血腦組織中14-3-3γ亞型表達特異性增高，14-3-3η表達下降，其他亞型在不同模型中表達變化不同或沒有明顯變化。
　　2.在缺血不同時間點14-3-3γ的表達變化不同。免疫組織化學結(jié)果顯示

5、大鼠永久性栓塞1小時14-3-3γ表達開始增高、1天時表達下降、3天表達又增高；免疫細胞熒光、PCR及Western blot結(jié)果證實在原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中14-3-3γ在缺糖缺氧（OGD）處理后早期表達增高，晚期細胞損傷嚴重時表達下降。
　　3.證實14-3-3γ對缺血損傷的神經(jīng)元有保護作用。碘化丙啶（PI）染色結(jié)果顯示用抑制肽Difopein抑制內(nèi)源性14-3-3蛋白表達后，正常培養(yǎng)及OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡明顯增加。在O

6、GD處理的小鼠成神經(jīng)瘤N2a細胞中過表達14-3-3蛋白不同亞型后用乳酸脫氫酶（LDH）檢測細胞毒性，結(jié)果顯示γ亞型對細胞有明顯保護作用。在OGD不同時間點處理的原代皮質(zhì)神經(jīng)元中PI染色結(jié)果進一步證實shRNA敲除內(nèi)源性14-3-3γ顯著加重神經(jīng)元死亡，而過表達14-3-3γ對缺血損傷的神經(jīng)元有保護作用。PCR、細胞免疫熒光及組織化學結(jié)果證實在缺血神經(jīng)元中Bax凋亡信號途徑明顯激活，14-3-3γ能夠下調(diào)Bax的表達。
　　4.1

7、4-3-3γ對缺血神經(jīng)元的保護作用主要通過結(jié)合磷酸化β-catenin下調(diào)Bax來實現(xiàn)。采用免疫共沉淀的方法觀察14-3-3γ與凋亡蛋白的相互作用，結(jié)果顯示在OGD處理的神經(jīng)元中14-3-3γ與磷酸化Bad結(jié)合隨OGD時間的延長而減少，與Bax沒有結(jié)合，而14-3-3γ與磷酸化的β-catenin Ser37結(jié)合隨處理時間延長明顯增加。用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法也證實14-3-3γ與磷酸化β-catenin Ser37的相互作用。在N2a

8、細胞中14-3-3γ增強β-catenin的活性，β-catenin Ser37位點的去磷酸化使Bax的表達下降。Western blot、PI染色結(jié)果證實用化學合成的siRNA抑制內(nèi)源性β-catenin的表達可阻斷14-3-3γ對缺血損傷神經(jīng)元的保護作用。同時我們在缺血的星形膠質(zhì)細胞中采用免疫共沉淀的方法證實14-3-3γ與磷酸化的β-catenin Ser37沒有結(jié)合，Bax表達變化不明顯，表明14-3-3γ在缺血的神經(jīng)元和星形膠

9、質(zhì)細胞中的保護機制不同。
　　5.在動物體內(nèi)進一步證實14-3-3γ的缺血保護作用。在SD大鼠腦內(nèi)過表達慢病毒14-3-3γ，永久性栓塞1小時后2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色顯示過表達14-3-3γ使缺血梗死灶體積明顯減小。
　　結(jié)論：
　　在缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中14-3-3蛋白中的γ亞型表達特異性升高，其保護神經(jīng)元凋亡的作用主要通過結(jié)合磷酸化的β-catenin下調(diào)Bax來完成。這一研究結(jié)果為治療缺血性