14-3-3σ在UVB誘導(dǎo)的人表皮細(xì)胞輻射損傷中的作用及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、日益增強(qiáng)的紫外線輻射不僅會(huì)傷害人的皮膚、眼睛，破壞人的免疫系統(tǒng)，還會(huì)對(duì)地球上的其他生物及糧食作物等造成危害。因此，UVB對(duì)生物體的損傷作用也越來(lái)越引起相關(guān)科研工作者的關(guān)注。
　　有研究發(fā)現(xiàn)14-3-3σ(SFN或Stratifin)蛋白是表皮細(xì)胞DNA損傷的標(biāo)記物;此外，有研究表明，在一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在14-3-3σ表達(dá)的異常，如乳腺癌、肺癌中的14-3-3σ表達(dá)下調(diào)，然而在皮膚鱗癌中的表達(dá)未見(jiàn)相關(guān)研究。
　　研究目的

2、：
　　探討14-3-3σ在30mJ/cm2的UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖和周期變化中的作用機(jī)制，并進(jìn)一步探索14-3-3σ的下游信號(hào)分子，以及14-3-3σ在皮膚鱗癌中的表達(dá)情況。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)
　　人表皮細(xì)胞HaCaT購(gòu)自中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，人皮膚鱗癌A431細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)中科院上海細(xì)胞庫(kù)。穩(wěn)定干擾14-3-3σ細(xì)胞株HaCaTKD14-3-3σ

3、由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。A431細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞均培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10％的新生牛血清中、1×105U/L的青霉素、質(zhì)量濃度100mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。另外，HaCaTKD細(xì)胞額外加入終濃度為100μg/ml的Geneticin(G418)。
　　2.細(xì)胞分組、UVB照射
　　待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿80％～90％面積時(shí)，用PBS洗細(xì)胞2次，每個(gè)

4、時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)皿。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將皿隨機(jī)分為對(duì)照組和UVB組，然后均加入一定量的PBS(其中10cm培養(yǎng)皿加5mL PBS，6cm皿1.9mL PBS，96孔板加28μLPBS)，對(duì)照組進(jìn)行假照（即除不照射UVB外，其余處理過(guò)程均與處理組一致），UVB組置于距離光源垂直距離40cm的紫外光源箱體指定位置，接受UVB照射3min，累計(jì)照射劑量為30mJ/cm2;紫外輻射后均更換新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng)至照射后3、6、12、18

5、、24和30h時(shí)間點(diǎn)，收集HaCaT細(xì)胞總蛋白和RNA，其中UVB處理那一刻收集的細(xì)胞作為對(duì)照組(0h)。
　　3.結(jié)晶紫染色
　　HaCaT細(xì)胞和HaCaTKD細(xì)胞均按每皿3×105個(gè)細(xì)胞接種于3.5cm的培養(yǎng)皿中，待HaCaT細(xì)胞長(zhǎng)至70％～80％融合度時(shí)，兩種細(xì)胞分別接受0、10、20、30、40、50、60和80mJ/cm2的UVB照射，48h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，×200顯微鏡下隨機(jī)拍攝5個(gè)視野，計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)，以未照

6、組(0mJ/cm2)為參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　4.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　HaCaT細(xì)胞和HaCaTKD細(xì)胞按每孔8×103個(gè)細(xì)胞、每孔100μl的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24h后接受30mJ/cm2UVB照射，分別在照后0、12、24、48和72h時(shí)間點(diǎn)每孔加入10μl的CCK-8溶液，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)2h，測(cè)450nm的吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　5.PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期
　　HaCaT

7、細(xì)胞和HaCaTKD細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞分別接種在6cm培養(yǎng)皿中，待HaCaT細(xì)胞長(zhǎng)至70％～80％融合度時(shí)，兩組細(xì)胞分別接受30mJ/cm2的UVB照射，在照后0、6、12、18和24 h收集細(xì)胞，PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　6.蛋白質(zhì)印跡法
　　HaCaT細(xì)胞和HaCaTKD細(xì)胞按同種密度接種，待HaCaT和HaCaTKD分別長(zhǎng)至70％～80％融合度時(shí)，分別接受30mJ/cm2的UVB照射

8、。在照射后0、6、12、18和24 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。每孔加入20μg蛋白，5％的濃縮膠和10％的分離膠進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene，PVDF)膜上，5％的脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后二抗室溫孵育1h，ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　7.q-PCR法:
　　提取總的RNA，測(cè)量其濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，先通過(guò)PCR對(duì)引物進(jìn)行測(cè)

9、試。然后PCR擴(kuò)增cDNA，以cDNA為原料，進(jìn)行熒光定量PCR。將配置好的反應(yīng)體系分別加到q-PCR板中，測(cè)出CT值，根據(jù)公式計(jì)算出mRNA相對(duì)含量。
　　8.免疫組化
　　石蠟切片脫蠟和水化。3％ H2O2室溫孵育5-10分鐘;5～10％正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘;滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小時(shí)或4℃過(guò)夜;滴加適當(dāng)比例稀釋二抗;滴加適當(dāng)比例稀釋的SABC;顯色劑顯色。自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染

10、，脫水透明、封片，鏡檢。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　結(jié)果以(x)±S表示。采用SPSS20.0軟件分析。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均數(shù)的比較采用方差分析的Dunnett-t檢驗(yàn)，兩因素多時(shí)間點(diǎn)資料采用析因方差分析，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.UVB誘導(dǎo)14-3-3σ的mRNA和蛋白水平的表達(dá)升高
　　30mJ/cm2的UVB照射后0、6、12、18、2

11、4h，14-3-3σ的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，與0h組相比均升高，隨著時(shí)間的變化逐漸升高。
　　2.14-3-3σ對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響
　　不同劑量的UVB照射后48 h，UVB+HaCaT與UVB+HaCaTKD細(xì)胞密度呈劑量依賴性下降。未照射的HaCaT細(xì)胞與HaCaTKD細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與未照射組相比，HaCaT細(xì)胞在20mJ/cm2照射后可出現(xiàn)顯著抑制（P＜0.05）;HaCaTK

12、D細(xì)胞中在10mJ/cm2照射后即可出現(xiàn)顯著抑制(P＜0.05)。
　　經(jīng)析因方差分析，無(wú)UVB照射情況下:HaCaTKD細(xì)胞的增殖能力顯著低于HaCaT細(xì)胞(P＜0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩組進(jìn)行組間比較，除了48和72 h時(shí)間點(diǎn)HaCaT組值大于HaCaTKD組（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。固定分組進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。30mJ/cm2 UVB照射情況下:UVB+

13、HaCaTKD細(xì)胞的增殖能力低于UVB+HaCaT細(xì)胞(P＜0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩組進(jìn)行組間比較，除0h時(shí)間點(diǎn)外，其他時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.14-3-3σ對(duì)HaCaT細(xì)胞周期變化的影響
　　HaCaT細(xì)胞中處于G2/M期的細(xì)胞在6h開(kāi)始升高，12h出現(xiàn)一個(gè)峰值，18h顯著下降，且這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)和0h相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24h回到0h的水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05

14、）。而HaCaTKD細(xì)胞組，各觀察時(shí)間點(diǎn)與0h組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　HaCaT細(xì)胞組在UVB照射后6～18h發(fā)生G2/M期細(xì)胞比例上升，照射后6、12和18h的G2/M期含量與照射組0h相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;在HaCaTKD細(xì)胞中，照后6h時(shí)G2/M期短暫升高，然后逐漸下降，未見(jiàn)明顯G2/M期阻滯作用（P＞0.05）。
　　4.UVB照射后，14-3-3σ及下游周期相關(guān)蛋白的表

15、達(dá)
　　正常的HaCaT中，與照射前相比，照射后6，12，18，24h，14-3-3σ表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），Cdc2下調(diào)(P＜0.05)，24h未見(jiàn)回升;Cdc25c、CyclinB1下調(diào)(P＜0.05)，Cdc25c在24 h略有回升，CyclinB1在18、24 h略有回升。在HaCaTKD細(xì)胞中，照后24h與照射前比，14-3-3σ表達(dá)量升高較明顯(P＜0.05);照后12，18，24h，Cdc25c、Cyclin

16、B1下調(diào)（P＜0.05），Cdc2表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著改變（P＞0.05）。
　　5.UVB照射后，14-3-3σ與TPD52L1的協(xié)同作用
　　測(cè)序分析發(fā)現(xiàn):UVB照射后，14-3-3σ的轉(zhuǎn)錄水平先逐漸上升，然后下降，而TPD52L1的轉(zhuǎn)錄水平則是先下降后上升，他們呈相反的趨勢(shì)。進(jìn)一步通過(guò)q-PCR法驗(yàn)證14-3-3σ和TPD52L1的mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)14-3-3σ和TPD52L1的mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一

17、致。
　　14-3-3σ的表達(dá)水平逐漸上升，至18h達(dá)到最大值后開(kāi)始下降，而TPD52L1的表達(dá)水平也逐漸上升至24h達(dá)到峰值后逐漸下降。14-3-3σ與TPD52L1的蛋白水平的變化趨勢(shì)卻是基本一致。
　　6.14-3-3σ在皮膚鱗癌細(xì)胞和皮膚鱗癌組織樣本中的表達(dá)情況
　　14-3-3σ在皮膚鱗癌細(xì)胞A431細(xì)胞株中的表達(dá)低于正常皮膚細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株，14-3-3σ在皮膚鱗癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織