14-3-3蛋白在阿爾茨海默病SET核運(yùn)輸中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 探討過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ對(duì)SET核運(yùn)輸障礙的影響及其潛在的分子機(jī)制，為AD藥物開發(fā)提供有效的分子靶點(diǎn)。
　　背景：PP2A活性下降導(dǎo)致 tau過(guò)度磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)形成，是阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核蛋白SET是體內(nèi)PP2A特異、高效的抑制劑，主要分布在

2、嗅球、海馬、大腦皮質(zhì)、尾殼核、丘腦等腦區(qū)。AD患者經(jīng)免疫化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)SET表達(dá)水平明顯增高，而且細(xì)胞定位也從細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞漿，并且發(fā)現(xiàn)SET共定位于神經(jīng)元胞漿內(nèi)PP2A及過(guò)度磷酸化的tau蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)SET導(dǎo)致大鼠PP2A活性顯著降低，tau異常過(guò)度磷酸化，神經(jīng)元退變，甚至出現(xiàn)AD患者樣運(yùn)動(dòng)功能障礙的表現(xiàn)。上述研究結(jié)果說(shuō)明：作為PP2A上游調(diào)節(jié)因子，SET在AD腦內(nèi)自核轉(zhuǎn)運(yùn)并滯留于胞漿聚集是引起AD發(fā)病的一個(gè)非常關(guān)鍵的

3、因素。因此，明確AD腦內(nèi)SET核運(yùn)輸?shù)木唧w機(jī)理將有助于詮釋AD的發(fā)病機(jī)制。然而SET如何轉(zhuǎn)運(yùn)并聚積于胞漿內(nèi)，以及PP2A活性被SET所抑制的具體分子機(jī)制尚不清楚。前期針對(duì)SET核運(yùn)輸相關(guān)的核定位信號(hào)(Nuclear localization signal,NLS)序列展開了相應(yīng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ser-9位點(diǎn)磷酸化失活SET核定位信號(hào)，造成核輸入蛋白不能正常結(jié)合SET，導(dǎo)致SET滯留胞漿。然而，AD患者腦內(nèi)SET Ser-9磷酸化的分子機(jī)

4、制及其它可能致SET滯留胞漿聚集的機(jī)制有待進(jìn)一步明確。14-3-3蛋白作為接頭/支架蛋白與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，廣泛參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)進(jìn)程。近來(lái)更多的研究揭示了14-3-3蛋白在核運(yùn)輸中的調(diào)控作用。比如Cdc25蛋白的Ser-216被磷酸化后可以與14-3-3ε結(jié)合形成Cdc25/14-3-3ε復(fù)合物，并導(dǎo)致Cdc25不能結(jié)合importinα正常進(jìn)入到細(xì)胞核中，類似的還有RSG，HDAC4蛋

5、白等。這些研究均提示：14-3-3蛋白對(duì)于核-漿穿梭蛋白的核輸入具有負(fù)調(diào)作用。同時(shí)，14-3-3β/δ在AD患者腦內(nèi)過(guò)表達(dá)，存在于NTFs中，與AD患病進(jìn)程正相關(guān)。這些研究提示：14-3-3β/δ蛋白參與了AD的病理過(guò)程，但具體機(jī)制不明。具有核輸入負(fù)調(diào)作用的14-3-3蛋白與其靶蛋白結(jié)合存在識(shí)別序列 RX1-2SX2-3S(X代表基本氨基酸)，通過(guò)篩選SET的全長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)其146 NESGDPSSKST156序列，符合14-3-3蛋白識(shí)別

6、序列RX1-2SX2-3S，提示：14-3-3蛋白可能通過(guò)結(jié)合SET導(dǎo)致其滯留胞漿，抑制PP2A活性，參與AD發(fā)病。本研究證實(shí)：14-3-3通過(guò)與核輸入蛋白 importinα競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 SET，導(dǎo)致核輸入復(fù)合物形成障礙，SET入核困難而滯留胞漿，進(jìn)而引起AD下游病理事件。
　　目的：探討過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ對(duì)SET核運(yùn)輸障礙的影響及其潛在的分子機(jī)制，為AD藥物開發(fā)提供有效的分子靶點(diǎn)。
　　方法：培養(yǎng)HEK293/tau

7、細(xì)胞，轉(zhuǎn)染表達(dá)14-3-3β/δ48 h后通過(guò)共聚焦/雙光子顯微鏡和WB檢測(cè)SET的亞細(xì)胞分布。通過(guò)Co-IP方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ組SET與14-3-3β/δ及核輸入蛋白Importinα的結(jié)合程度。通過(guò)篩選SET全長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)其146 NESGDPSSKST156序列，符合14-3-3蛋白識(shí)別序列RX1-2SX2-3S，為此，合成具有穿膜和透血腦屏障功能的純化Tat肽段Tat-NESGDPSSKST(Peptide1)，和亂序

8、序列作為對(duì)照的Tat肽段Tat-NSSTEDGPKSS(Peptide2)。在HEK293/tau細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)14-3-3δ的同時(shí)加入人工合成并純化Tat肽段，48h后通過(guò)共聚焦/雙光子顯微鏡和WB檢測(cè)SET的亞細(xì)胞分布。通過(guò)Co-IP方法檢測(cè)加入Peptide1/2組是否影響SET與14-3-3β/δ及核輸入蛋白Importinα的結(jié)合。通過(guò)PP2A活性檢測(cè)試劑盒(Promega, Cat.＃ V2460)測(cè)定過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ

9、及Peptide1/2干預(yù)后對(duì)PP2A活性的影響。利用免疫印跡方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ，SET，14-3-3β/δ+SET后對(duì)tau蛋白Ser199，Ser202，Thr205，Thr231, Ser262，Ser396和 Ser404位點(diǎn)磷酸化程度的影響；人工包裝過(guò)表達(dá)14-3-3δ的腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)，通過(guò)腺相關(guān)投遞系統(tǒng)感染C57小鼠，分別用Peptide1/2干預(yù)，進(jìn)一步明確

10、SET與14-3-3蛋白的結(jié)合序列NESGDPSSKST，確定其可能成為促進(jìn)SET入核的小分子肽，為AD有些藥物開發(fā)提供候選分子靶點(diǎn)。通過(guò)條件恐懼實(shí)驗(yàn)，水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)行為學(xué)的變化，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細(xì)胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測(cè)神經(jīng)元樹突，樹突棘等的變化，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠海馬synaptotagmin， synaptophysin，

11、 synapsin1，phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)，NR1，NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。
　　結(jié)果：在HEK293/tau細(xì)胞株中，分別過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ導(dǎo)致大部分SET自核轉(zhuǎn)運(yùn)并滯留于胞漿。分別分離提取胞漿及胞核蛋白后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ組細(xì)胞核內(nèi)的SET蛋白量明顯減少，而在胞漿中明顯增加；通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)到過(guò)表達(dá)14-3-3β

12、/δ后SET與importinα結(jié)合減少導(dǎo)致SET核輸入障礙。還觀察到在轉(zhuǎn)染了14-3-3δ的HEK293/tau細(xì)胞株中，用Peptide1處理導(dǎo)致SET正常轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。利用核蛋白提取試劑盒分離提取胞漿與胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)核蛋白中Peptide1處理組的SET量明顯增高，而在胞漿蛋白中明顯減少；通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)到Peptide1處理組SET與importinα結(jié)合隨劑量逐漸增加。還觀察到過(guò)表達(dá)14-3-3β/δ后顯著抑制PP2A

13、活性，并導(dǎo)致tau蛋白在Ser199，Ser202，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396和 Ser404位點(diǎn)發(fā)生過(guò)度磷酸化，Peptide1處理可恢復(fù)PP2A活性。進(jìn)一步在小鼠海馬齒狀回(Dentategyrus，DG)定位注射AAV8-14-3-3δ病毒感染動(dòng)物，并用Peptide1/2干預(yù)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3δ后，小鼠情景恐懼實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶的障礙，而Peptide1處理可以有效恢復(fù)。激光共聚集

14、熒光顯微鏡下觀察到腦片中不同區(qū)域Peptide1可以恢復(fù)過(guò)表達(dá)14-3-3δ引起的SET胞漿滯留現(xiàn)象。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3δ可以顯著抑制LTP，而Peptide1處理可以有效恢復(fù)，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3δ可導(dǎo)致神經(jīng)元樹突長(zhǎng)度縮短，分支減少，樹突棘密度減少等變化，而Peptide1處理可以有效恢復(fù)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中，過(guò)表達(dá)14-3

15、-3δ可導(dǎo)致synaptotagmin，synaptophysin， synapsin1，phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少，NR2A：NR2B比值變大，SET Ser-9顯著磷酸化，Peptide1處理可以有效恢復(fù)上述變化。
　　結(jié)論：14-3-3β/δ可以通過(guò)與SET蛋白的NESGDPSSKST序列結(jié)合，導(dǎo)致SET與importinα結(jié)合顯著減少，從而引起SET核輸入障礙

16、，滯留胞漿，顯著抑制PP2A活性，并導(dǎo)致tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化，神經(jīng)元樹突損傷，LTP及學(xué)習(xí)和記憶的損傷。通過(guò)給予Tat-NESGDPSSKST肽段可以通過(guò)有效競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合14-3-3β/δ來(lái)釋放SET，使SET核輸入正常而主要定位與胞核，減少對(duì)胞漿中PP2A的抑制，恢復(fù)PP2A活性，減少神經(jīng)元樹突損傷，恢復(fù)LTP及學(xué)習(xí)和記憶的損傷等。
　　第二部分 探討14-3-3δ與CKII介導(dǎo)SET滯留胞漿的分子機(jī)制，進(jìn)一步闡明AD發(fā)病機(jī)制

17、。
　　背景：第一部分研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3δ導(dǎo)致SET滯留在胞漿，并伴有SET Ser-9磷酸化現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn) SET上游蛋白激酶 CKII在AD腦內(nèi)上調(diào)，二聚體的14-3-3δ可募集CKII。為此設(shè)想：14-3-3δ在結(jié)合SET的同時(shí)，也俘獲CKII，從而使得SET更容易成為CKII的底物被磷酸化，進(jìn)一步引起磷酸化SET與importinα結(jié)合障礙，導(dǎo)致SET滯留胞漿。
　　目的：探討14-3-3δ與CKII介導(dǎo)S

18、ET滯留胞漿的分子機(jī)制，進(jìn)一步闡明AD發(fā)病機(jī)制。
　　方法：通過(guò)海馬DG區(qū)注射AAV8-14-3-3δ病毒，感染C57小鼠，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片SET的亞細(xì)胞定位，以及SET、14-3-3δ及CKIIα的分布與共定位。培養(yǎng)HEK293/tau細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+/14-3-3δ48 h后，通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)SET、14-3-3δ及CKIIα的結(jié)合程度。使用CKII特異性抑制劑TBB（4,5,6,7-Tetra

19、bromobenzotriazole）處理轉(zhuǎn)染14-3-3δ的HEK293/tau細(xì)胞，檢測(cè)SET Ser-9磷酸化變化，SET表達(dá)量變化，CKIIα表達(dá)量變化。已轉(zhuǎn)染CKIIα的HEK293/tau細(xì)胞給予si14-3-3δ處理，檢測(cè)SET Ser-9磷酸化變化，SET表達(dá)量變化，CKIIα表達(dá)量變化。通過(guò)絲氨酸/蘇氨酸檢測(cè)試劑盒(Promega, Cat.＃ V2460)測(cè)定PP2A活性。人工包裝過(guò)表達(dá)CKIIα的AAV病毒感染C5

20、7小鼠，同時(shí)分別用AAV8-si14-3-3δ、AAV8-Ssi處理。通過(guò)條件恐懼實(shí)驗(yàn)，水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)行為學(xué)的變化，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細(xì)胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測(cè)神經(jīng)元樹突，樹突棘等的變化，免疫印跡檢測(cè)小鼠海馬synaptotagmin，synaptophysin，synapsin1， phosphorylated synapsin1

21、(p-synapsin1)，NR1，NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。
　　結(jié)果：過(guò)表達(dá)14-3-3δ的AAV8病毒感染C57小鼠腦片上，可以觀察到SET、CKIIα、14-3-3δ三者間可相互共定位，且過(guò)表達(dá)14-3-3δ動(dòng)物腦內(nèi)SET主要定位于胞漿。在HEK293/tau細(xì)胞株中，免疫共沉淀結(jié)果顯示SET、CKIIα、14-3-3δ三者間相互結(jié)合，且過(guò)表達(dá)14-3-3δ組的結(jié)合程度顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果

22、提示：14-3-3在結(jié)合SET的同時(shí)，也可募集CKIIα。已轉(zhuǎn)染14-3-3δ的HEK293/tau細(xì)胞給予CKII抑制劑TBB處理后發(fā)現(xiàn)，SET Ser-9磷酸化程度顯著降低；給予si14-3-3δ處理后發(fā)現(xiàn)，敲減14-3-3δ可導(dǎo)致SET Ser-9磷酸化程度降低。說(shuō)明CKIIα通過(guò)14-3-3δ的募集促進(jìn)對(duì)SET的磷酸化修飾。PP2A活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TBB處理可很好的恢復(fù)由于14-3-3δ引起的PP2A活性降低。人工包裝過(guò)表達(dá)CKII

23、α的AAV8病毒感染C57小鼠，同時(shí)分別用AAV8-si14-3-3δ、AAV8-Ssi處理，條件恐懼、水迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)si14-3-3δ處理可恢復(fù)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。激光共聚集熒光顯微鏡下可觀察到過(guò)表達(dá)CKIIα可促進(jìn)SET滯留于胞漿，而si14-3-3δ可恢復(fù)SET的核輸入。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CKIIα可以顯著抑制LTP，體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CKIIα可導(dǎo)致神經(jīng)

24、元樹突長(zhǎng)度縮短，分支減少，樹突棘密度減少等變化；免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中，過(guò)表達(dá)CKIIα可導(dǎo)致synaptotagmin， synaptophysin， synapsin1， phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少，NR2A：NR2B比值變大， SET Ser-9顯著磷酸化，si14-3-3δ處理可以有效恢復(fù)上述變化。
　　結(jié)論：14-3-3δ可同時(shí)結(jié)合CKIIα與