MicroRNA-153在阿爾茨海默病模型鼠發(fā)病機制中的作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)退行性變,是老年癡呆的主要類型,病理表現(xiàn)以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)為主。隨著現(xiàn)代社會人口老齡化趨勢的迅速增長,老年性疾病特別是老年癡呆發(fā)病率呈上升趨勢,嚴(yán)重影響老年人的生存質(zhì)量,然而,AD是一種多因素的復(fù)雜性疾病,其病因及發(fā)病機制迄今尚不明確。MicroRNA(miRNA)是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性小分子RNA,通過抑制轉(zhuǎn)錄后mRNA的翻譯而調(diào)控蛋白表達(dá)。越來越多的研

2、究表明在多種疾病的發(fā)生中miRNA均發(fā)揮著重要作用。其中,miRNA參與AD發(fā)病機制的文章也日見報道,然而,相關(guān)方面的研究尚處于初步階段,進(jìn)一步探討AD發(fā)病過程中異常表達(dá)的miRNA及其作用不僅可為AD發(fā)病機制提供新的詮釋且有望為治療提供新的途徑。
　　 APP(Amyloid protein precursor)是Aβ肽的前體蛋白,其表達(dá)水平的增加可直接導(dǎo)致Aβ肽生成增多從而成為AD的主要致病基因。APP屬于一類高度保守的跨膜

3、糖蛋白家族,哺乳動物的該家族成員還包括有APLP1和APLP2。多方研究證實APLP2在AD的發(fā)病機制中也起著重要作用。
　　 本課題通過對APPswe/PS△E9雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織miRNA表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn),在該AD模型小鼠體內(nèi)存在有miR-153的異常表達(dá)。定量PCR檢測進(jìn)一步證實了在3月齡及9月齡AD小鼠腦內(nèi),miR-153的表達(dá)顯著降低。經(jīng)數(shù)據(jù)庫預(yù)測,在APP和APLP2的3’UTR區(qū)均存在一miR-153的結(jié)合位點,熒

4、光素酶報告基因檢測試驗分別證明了這一位點的有效性。Western-blot檢測APPswe/PS△E9小鼠腦內(nèi)APLP2蛋白表達(dá)顯示:3月齡及9月齡AD小鼠腦APLP2的表達(dá)顯著增加。
　　 為進(jìn)一步驗證miR-153對APP和APLP2的靶向調(diào)控作用,構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)miR-153的SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系內(nèi)靶基因的表達(dá),結(jié)果顯示APP/APLP2的蛋白表達(dá)顯著降低。同時,定量PCR檢測顯示其mRNA水平也有一

5、定程度的降低,表明miR-153在抑制APP/APLP2 mRNA翻譯的同時也可影響其穩(wěn)定性。反之,使用miRNA inhibitor抑制M17細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的miR-153后,細(xì)胞內(nèi)APLP2蛋白水平顯著增加。將miR-153表達(dá)載體或陰性對照載體與含有全長3’UTR的APP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入HEK-293T細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染后48h檢測細(xì)胞內(nèi)APP蛋白及mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞試驗相一致,miR-153與APP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組APP的

6、蛋白及mRNA水平較陰性對照與APP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組顯著降低。將miR-153與APP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后24h的細(xì)胞經(jīng)mir-153 inhibitor或inhibitor control處理,48h后再檢測APP的蛋白表達(dá),結(jié)果表明,mir-153 inhibitor處理組較inhibitorcontrol組顯著增加,反向證明了miR-153的表達(dá)調(diào)控作用。
　　 為進(jìn)一步體內(nèi)驗證miR-153對APP/APLP2的調(diào)控作用,構(gòu)建了mi

7、R-153轉(zhuǎn)基因小鼠及雙突變的、含全長APP-3’UTR的人APPLon/Swe轉(zhuǎn)基因小鼠,并將這兩種小鼠雜交獲得了miR-153/APPLon/Swe雙陽小鼠。檢測miR-153轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的APLP2蛋白表達(dá),結(jié)果顯示與對照相比,其APLP2蛋白水平顯著降低。同時對miR-153/APPLon/Swe雙陽小鼠腦內(nèi)APP的蛋白表達(dá)檢測結(jié)果顯示,與APPLon/Swe單陽小鼠相比,其APP蛋白水平也在一定程度上有所降低。
　　

8、 為驗證在腦正常發(fā)育過程中miR-153對APP/APLP2的調(diào)控作用,檢測了妊娠17.5天-12月齡野生C57小鼠腦內(nèi)miR-153及APP/APLP2的蛋白和mRNA表達(dá),結(jié)果顯示,在該發(fā)育階段內(nèi)miR-153表達(dá)與APP/APLP2的蛋白水平呈反向相關(guān)趨勢,而相對于APP/APLP2的蛋白水平而言,其mRNA水平變化不顯著,表明在正常鼠腦發(fā)育過程中,其表達(dá)受miR-153的調(diào)控。
　　 因Aβ42肽和氧化應(yīng)激在AD的發(fā)病機

9、制中起著重要作用,且目前有文獻(xiàn)報道兩者均可影響細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá),為驗證其對miR-153表達(dá)水平的影響,將M17細(xì)胞分別經(jīng)Aβ42和H2O2處理后,在不同時間檢測其miR-153及APLP2的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,Aβ42和H2O2處理后可導(dǎo)致miR-153表達(dá)水平的改變,且其變化與作用時間相關(guān)。與之相應(yīng),隨著miR-153水平的波動,APLP2的蛋白表達(dá)呈相反的變化趨勢。表明Aβ42肽和氧化應(yīng)激可影響miR-153的表達(dá),從而導(dǎo)致