基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的分析方法在藥物代謝及脂質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography coupled to mass spectrometry，LC-MS/MS）的發(fā)展，質(zhì)譜作為常用的檢測技術(shù)逐漸涉及不同應(yīng)用領(lǐng)域。目前，三重四極桿質(zhì)譜儀（QQQ）及三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（QTRAP）主要應(yīng)用于定量分析，比如藥代動(dòng)力學(xué)、代謝穩(wěn)定性、藥物相互作用等研究領(lǐng)域，高分辨質(zhì)譜儀（HRMS）則主要應(yīng)用于定性分析，比如藥物代謝、中藥復(fù)雜成分鑒定、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)

2、等研究領(lǐng)域。而建立同一個(gè)儀器平臺(tái)同時(shí)用于定性定量分析或整合運(yùn)用不同特點(diǎn)的質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，是質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展的趨勢之一。三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（QTRAP）既具有用于定量分析的高靈敏度、高選擇性的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式，也具有多種用于定性分析信息關(guān)聯(lián)采集功能，適用于進(jìn)行定性、定量研究。并且針對不同的研究目的，已經(jīng)應(yīng)運(yùn)而生了多種基于QTRAP質(zhì)譜儀的定性分析方法。然而，這些分析方法中，有些由于選擇性較差，不適于微量成分的檢測，而

3、有些則因?yàn)榉椒ㄐ枰鶕?jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行設(shè)置，普適性差。本課題以QTRAP作為主要的儀器分析平臺(tái)，從代謝軟點(diǎn)鑒定、I相代謝產(chǎn)物和谷胱甘肽結(jié)合物的鑒定、血清中溶血磷脂類成分鑒定三個(gè)不同研究方向，介紹如何運(yùn)用單一的儀器平臺(tái)建立高效、簡單、靈敏度高的分析方法進(jìn)行藥物代謝研究，以及如何將QTRAP與HRMS聯(lián)合使用建立靈敏度高、重現(xiàn)性好且代謝物覆蓋面廣的分析方法對內(nèi)源性溶血磷脂類成分的靶標(biāo)性分析。本文主要分為以下幾部分:
　　第一部分:

4、應(yīng)用QTRAP質(zhì)譜儀快速、準(zhǔn)確、靈敏地鑒定化合物的代謝軟點(diǎn)
　　本研究運(yùn)用體外肝微粒孵育的方法，先進(jìn)行代謝穩(wěn)定研究，求算每個(gè)化合物的體外半衰期（t1/2）。在鑒定化合物的代謝軟點(diǎn)時(shí)，每個(gè)化合物的孵育時(shí)間可根據(jù)其t1/2設(shè)置，且選擇較低的底物濃度3.00μM進(jìn)行孵育，從而確?；衔镌诰€性酶動(dòng)力學(xué)的條件下進(jìn)行反應(yīng)，減少非主要代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。由于化合物的代謝軟點(diǎn)往往為I相代謝產(chǎn)物，代謝酶種類較多，代謝途徑難以預(yù)測，因此，本實(shí)驗(yàn)采用基于Q

5、TRAP質(zhì)譜儀的掃描范圍寬而又不失選擇性和靈敏度的多離子掃描模式（MIM）進(jìn)行信息關(guān)聯(lián)采集（IDA），從而同時(shí)獲得原型及代謝產(chǎn)物的碎片離子信息。此外，該研究同時(shí)使用紫外檢測器（UV）對代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)分析階段，先根據(jù)UV相對定量的結(jié)果快速確定主要代謝產(chǎn)物，然后根據(jù)對應(yīng)色譜峰的二級碎片離子確定可能的代謝位點(diǎn)。該方法成功運(yùn)用于具不同代謝速率的五個(gè)化合物（咪達(dá)唑侖、右美沙芬、維拉帕米、阿莫地喹及氯氮平）的代謝軟點(diǎn)分析。本試驗(yàn)首次從樣品孵

6、育條件和檢測方法兩個(gè)方面提高鑒定化合物代謝軟點(diǎn)的準(zhǔn)確性和高通量性。
　　第二部分:建立同時(shí)鑒定I相代謝產(chǎn)物及谷胱甘肽結(jié)合物的LC-QTRAP-MS/MS分析方法
　　本研究建立基于QTRAP質(zhì)譜儀的同時(shí)檢測I相代謝產(chǎn)物和谷胱甘肽結(jié)合物（GSH）的分析方法。該方法整合MIM掃描模式及多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式進(jìn)行信息關(guān)聯(lián)采集（IDA）并獲取代謝產(chǎn)物的碎片離子信息，其中MIM掃描模式用于檢測代謝途徑多樣且難于預(yù)測的I相代謝產(chǎn)物

7、，而MRM掃描模式用于檢測含量相對低且裂解規(guī)律相似的GSH結(jié)合物。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，運(yùn)用多種數(shù)據(jù)處理方法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，快速鑒定代謝產(chǎn)物，并根據(jù)UV的相對定量的結(jié)果快速判斷主要代謝產(chǎn)物。本研究通過同時(shí)檢測I相代謝產(chǎn)物和GSH結(jié)合物，有助于闡明藥物在體內(nèi)形成反應(yīng)性代謝中間體生物合成途徑。該方法首次利用QTRAP同時(shí)檢測I相代謝產(chǎn)物和GSH結(jié)合物，并應(yīng)用于氯氮平及諾米芬辛的I相代謝產(chǎn)物及谷胱甘肽結(jié)合物的鑒定，以闡述了兩個(gè)化合物的主要代謝

8、途徑及生物活化途徑。
　　第三部分:建立基于組合LC-MS/MS技術(shù)的血清溶血磷脂類成分表征的分析方法及應(yīng)用
　　磷脂類成分往往具有一定的結(jié)構(gòu)相關(guān)性或相同的結(jié)構(gòu)母核，因而同一類結(jié)構(gòu)母核的成分具有相似的質(zhì)譜裂解規(guī)律。本研究利用該特征整合運(yùn)用LC-QTRAP-MS/MS和LC-QTOF-MS/MS對血清中的六種不同類型的溶血磷脂類（Lyso-PLs）成分進(jìn)行全面的表征和鑒定。首先，根據(jù)每一類Lyso-PLs的質(zhì)譜裂解規(guī)律，預(yù)測該

9、類成分的MRM離子對，然后利用QTRAP質(zhì)譜儀的MRM-IDA-EPI掃描模式對所預(yù)測的化合物進(jìn)行檢測，得到所有可能Lyso-PLs的二級碎片離子信息。最后結(jié)合QTOF質(zhì)譜儀提供的高分辨精確分子量，確定每一種Lyso-PLs的分子組成。本研究應(yīng)用該分析策略首次對人及四種嚙齒類動(dòng)物（大鼠、小鼠、豚鼠和倉鼠）血清樣品中Lyso-PLs類成分進(jìn)行全面的定性分析，共檢測到317個(gè)Lyso-PLs類成分，并且系統(tǒng)地比較了人和四個(gè)種屬嚙齒類動(dòng)物血清