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文檔簡(jiǎn)介
1、知母是百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖,為中國(guó)藥典收載的常用中藥之一,味甘、苦,性寒,入肺、胃、腎經(jīng),具有清熱瀉火、生津潤(rùn)燥之功效。其化學(xué)成分主要有甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、有機(jī)酸類、生物堿、黃酮類、多糖類、微量元素及大量的黏液質(zhì)等。具有抗炎、抗菌及鎮(zhèn)痛解熱作用以及抗衰老、抗血小板聚集、降血糖作用。目前知母及其復(fù)方制劑已廣泛的用于臨床。本文采用LC-MS作為主要分析方法,利用其快
2、速高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),對(duì)知母中的化合物進(jìn)行定量分析,并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效合理的控制。同時(shí)研究了知母貝母復(fù)方制劑(二母制劑)的6種成分在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程和排泄規(guī)律,為進(jìn)一步合理使用中藥復(fù)方提供理論基礎(chǔ)。
第一部分:HPLC-MS法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析測(cè)定知母中的9種成分
目的:建立一種快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)測(cè)定知母中9種化學(xué)成分(4種甾體皂苷成分、2種雙苯吡酮、2種異黃酮及1個(gè)蒽
3、醌類化合物)的HPLC-ESI-MS分析方法,并采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析對(duì)不同來(lái)源知母與知母的不同部位的質(zhì)量進(jìn)行有效合理的分析。
方法:取知母藥材粉末約1.0g,精密稱定,加入30mL乙醇,密塞,稱定重量,超聲處理60min,放冷,稱重,用乙醇補(bǔ)足至原重量后,搖勻,過(guò)濾(0.45μm微孔濾膜),取續(xù)濾液,10μL進(jìn)樣后測(cè)定。含量測(cè)定方法的建立在MRM正負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行,并對(duì)30批不同來(lái)源的知母和知母不同部位進(jìn)行測(cè)定分析,聚類
4、分析和主成分分析對(duì)30批樣品的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行區(qū)分和分類。質(zhì)譜色譜條件:電噴霧離子源(ESI);正負(fù)離子在同一周期內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)換同時(shí)監(jiān)測(cè);源噴射電壓(正離子)5500V;(負(fù)離子)-4500V。離子源溫度:600℃。霧化氣(Gas1):40psi,加熱氣(Gas2):50psi,簾氣:25psi。色譜條件:色譜柱:DiamonsilC18column(250mm×4.6mm,5μm);柱溫:30℃;洗脫程序:0-2.5min,流動(dòng)相乙腈-0
5、.1%甲酸水(5∶95,v/v)線性變至乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v);2.5-5min,流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v)線性變至為乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v);5-20min,乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v)下等度洗脫;最后流動(dòng)相的比例迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽畛醯囊译?0.1%甲酸水(5∶95,v/v)。每次進(jìn)樣前要預(yù)平衡6min,再進(jìn)行梯度洗脫。運(yùn)行時(shí)間:20min;流速:800μL/min,進(jìn)樣
6、量10μL。
結(jié)果:在一定濃度區(qū)間內(nèi)9種活性成分的線性關(guān)系良好,r2>0.9912;日內(nèi)和日間精密度分別小于2.21%和2.34%;平均回收率96.8%~103.9%,RSD0.81to2.32%;樣品儲(chǔ)存于4℃,48h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD<2.28%)。30批樣品含量采用上述HPLC-ESI-MS方法測(cè)得。同一周期內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)換正負(fù)離子源20min內(nèi)可完成一次分析。MRM正負(fù)離子掃描模式降低了噪音水平,提高了分析的靈敏度。3
7、0批樣品總含量范圍為23.01到132.65mg/g,含量差異較大。HB-4,HB-5和HB-6含量最高(132.65,120.59,and116.92mg/g);而HBL-1,HBL-2和HBL-3含量最低(23.01,34.09,and29.68mg/g)。30批樣品總含量平均值90.46mg/g。6批樣品(HBP-1,-2,-3andHBS-1,-2,-3)略低于平均總含量,HBL-1,-2,-3總含量最低。知母皂苷BⅡ是樣品中含
8、量最高的活性成分43.79mg/g,其次是芒果苷36.13mg/g。主成分分析及聚類分析對(duì)30批知母藥材成功分類區(qū)分,證明了道地藥材質(zhì)量最佳。知母地上地下部分均含有活性成分,并且含量較高,也應(yīng)得到充分的開(kāi)發(fā)利用。
結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便快速,靈敏度高,選擇性好,為知母藥材的質(zhì)量控制提供了新的方法和手段。
第二部分:HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠口服知母、貝母與復(fù)方提取物后血漿中6種成分及其藥動(dòng)學(xué)比較
目
9、的:二母制劑,用于治療哮喘和支氣管炎癥的傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑,最早記載于我國(guó)古代的《景岳全書(shū)》和《急救仙方》等著名方劑學(xué)中醫(yī)古籍中。該制劑不僅在中國(guó)有悠久的歷史,在東方國(guó)家如韓國(guó)也被廣泛使用治療咳嗽和哮喘。二母制劑由知母和貝母兩種藥材等比例組合后提取制備。新芒果苷、芒果苷、貝母素甲、貝母素乙、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ是二母制劑中的主要活性成分。該研究建立一種基于多組分同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中新芒果苷、芒果苷、貝母素甲、貝母素乙、知母皂苷BⅡ和知
10、母皂苷AⅢ含量的HPLC-MS方法,并用于大鼠灌胃給予知母、貝母單味藥材提取物和知母、貝母混合提取物后該6種成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究,建立其藥-時(shí)曲線,闡明各自藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與特征,并比較了單方與復(fù)方制劑的藥動(dòng)學(xué)差異,考察了配伍對(duì)活性成分藥動(dòng)學(xué)的影響。
方法:知母(100g)、貝母(100g)粉碎后分別用70%乙醇按1∶10,1∶10,1∶5的比例回流提取3次后濃縮至2g/mL的提取物。知母和貝母提取物按1∶1比例混合后制成二母制
11、劑。知母和貝母提取物中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、含量分別為8.76,21.16,74.24,4.16,0.32和0.57mg/mL。
大鼠隨機(jī)分為3組,分別灌胃給予單味知母或貝母提取物,知母、貝母混合提取物后,由眼眥靜脈叢取血,取血時(shí)間為5,10,15,30,60,120,180,240,360,480,600,1440,2160和2880min。樣品置于肝素化的試管內(nèi),離心得到上清液為血漿樣品,采用沉
12、淀蛋白法預(yù)處理樣品,內(nèi)標(biāo)為磺胺甲噁唑。C18色譜柱,洗脫程序0-7.0min,流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(5∶95,v/v)線性變至乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v);7.0-10.0min,流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v)線性變至乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v);10.0-15.0min,乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v)下等度洗脫;最后10.0-15.2min流動(dòng)相的比例迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽畛醯囊译?0
13、.1%甲酸水(5∶95,v/v)。每次進(jìn)樣前要預(yù)平衡6min,再進(jìn)行梯度洗脫。流速:800μL/min,進(jìn)樣量10μL。離子源為電噴霧(ESI),正負(fù)離子多周期同時(shí)掃描,多反應(yīng)模式監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行定量。監(jiān)測(cè)分為3個(gè)階段,0-6.19min在負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)新芒果苷和芒果苷;6.19-6.22min由負(fù)離子模式轉(zhuǎn)換成正離子模式;之后在正離子模式下監(jiān)測(cè)知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、貝母素甲、貝母素乙和內(nèi)標(biāo)。6種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為新芒果
14、苷m/z583.0/331.0,芒果苷m/z421.1/301.0,貝母素甲m/z432.5/414.5,貝母素乙m/z430.5/412.5,知母皂苷BⅡm/z903.1/417.2,知母皂苷AⅢm/z741.4/417.3和磺胺甲噁唑m/z254.0/156.0。
藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)采用非室模型處理,用excel軟件分析數(shù)據(jù)。達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和峰濃度(Cmax)由血藥濃度曲線直接獲得。消除常數(shù)(k)由曲線最后4個(gè)點(diǎn)的斜率的
15、對(duì)數(shù)計(jì)算得到。消除半衰期T1/2=0.693/k。
結(jié)果:血漿中新芒果苷、芒果苷、貝母素甲、貝母素乙、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ分別在4.63~1852.8、2.92~1168、3.56~1424、4.44~1776、4.40~1760和4.00~1600ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.9946),最低定量限(LLOQ)≤2.27ng/mL。日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于7.8%,相對(duì)誤差(RE)為
16、-7.4%~7.4%。平均提取回收率為80.6%~102.3%。大鼠灌胃知母或貝母單味提取物和混合提取物后新芒果苷、芒果苷、貝母素甲和貝母素乙的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有顯著性差異(P<0.05)。與灌胃知母提取物相比,復(fù)方提取物大鼠的芒果苷和新芒果苷的Cmax和AUC均顯著增加,T1/2有所下降,Tmax無(wú)顯著性差異。灌胃知母和灌胃復(fù)方制劑后,知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)沒(méi)有顯著性差異。與灌胃貝母提取物相比,灌胃復(fù)方提取物大鼠的貝母素甲和
17、貝母素乙的Cmax和AUC都顯著增加,T1/2明顯延長(zhǎng),Tmax無(wú)顯著性差異。
結(jié)論:該法靈敏度高、選擇性好、精密度好,節(jié)約時(shí)間和試劑,可用于大鼠灌胃提取物后血漿中新芒果苷、芒果苷、貝母素甲、貝母素乙、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的藥動(dòng)學(xué)研究。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果由此可推斷二者配伍可影響活性成分的藥動(dòng)學(xué)特征,并可以初步推斷知母和貝母配伍的合理性。
第三部分HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠口服知母、貝母與復(fù)方提取物后膽汁和
18、尿液中6種成分及其在膽汁和尿液中的排泄動(dòng)力學(xué)
目的:二母制劑,用于治療哮喘和支氣管炎癥的傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑,最早記載于我國(guó)古代的《景岳全書(shū)》和《急救仙方》等著名方劑學(xué)中醫(yī)古籍中。該制劑不僅在中國(guó)有悠久的歷史,在東方國(guó)家如韓國(guó)也被廣泛使用治療咳嗽和哮喘。二母制劑由知母和貝母兩種藥材等比例組合后提取制備。新芒果苷、芒果苷、貝母素甲、貝母素乙、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ是二母制劑中的主要活性成分。本研究建立一種可同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁和
19、尿液中6種成分——新芒果苷、芒果苷、貝母素甲、貝母素乙、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ含量的HPLC-MS方法,并用于大鼠灌胃給予單味知母或貝母藥材提取物和二母混合藥材提取物后,該6種成分的膽汁和尿液排泄動(dòng)力學(xué)研究。通過(guò)比較口服不同提取物后的排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù),考察其配伍對(duì)活性成分的排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。
方法:健康SD雄性大鼠18只,隨機(jī)分為3組,每組6只,大鼠分別灌胃給予單味知母或貝母藥材提取物和知母貝母混合藥材提取物,麻醉后
20、行膽管切開(kāi)術(shù),分別在2,4,6,8,10,24,36和48h收集膽汁樣品。另取
SD大鼠18只,隨機(jī)分為3組,每組6只,大鼠分別灌胃給予單味知母或貝母藥材提取物和二母混合藥材提取物,收集0-4,4-8,8-12,12-24,24-36,36-48,48-60和60-72h尿液。采用直接進(jìn)樣的方法進(jìn)行樣品前處理,內(nèi)標(biāo)為SMZ。C18柱,洗脫程序0-7.0min,流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(5∶95,v/v)線性變至乙腈-0.
21、1%甲酸水(55∶45,v/v);7.0-10.0min,流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v)線性變至為乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v);10.0-15.0min,乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v)下等度洗脫;最后10.0-15.2min流動(dòng)相的比例迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽畛醯囊译?0.1%甲酸水(5∶95,v/v)。每次進(jìn)樣前要預(yù)平衡6min,再進(jìn)行梯度洗脫。流速:800μL/min,進(jìn)樣量10μL。離子源為電噴霧(ES
22、I),正負(fù)離子多周期同時(shí)掃描,多反應(yīng)模式監(jiān)測(cè)(MRM)。監(jiān)測(cè)分為3個(gè)階段,0-6.19min在負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)新芒果苷和芒果苷;6.19-6.22min由負(fù)離子模式轉(zhuǎn)換成正離子模式;之后在正離子模式下監(jiān)測(cè)知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、貝母素甲、貝母素乙和內(nèi)標(biāo)。6種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為新芒果苷m/z583.0/331.0,芒果苷m/z421.1/301.0,貝母素甲m/z432.5/414.5,貝母素乙m/z430.5/412.5,知母
23、皂苷BⅡm/z903.1/417.2,知母皂苷AⅢm/z741.4/417.3和磺胺甲噁唑m/z254.0/156.0。測(cè)定大鼠灌胃給予不同提取物后膽汁和尿液中6種化學(xué)成分累積排泄率。
結(jié)果:結(jié)果表明,所測(cè)的6種活性成分僅有不足7%的原型從尿液中排出;不足5%的原型從膽汁排泄。灌胃知母貝母復(fù)方提取物和單方提取物后該6種成分表現(xiàn)出顯著不同的排泄行為。灌胃復(fù)方提取物后6種化合物在尿液中的排泄水平均高于單方提取物的排泄水平(約4
24、倍到14倍)。而在膽汁排泄中,灌胃復(fù)方提取物后只有芒果苷、貝母素甲和貝母素乙的排泄水平高于單方提取物,其余3種成分新芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的排泄水平均低于單方提取物。
結(jié)論:經(jīng)方法學(xué)考察符合生物樣品的測(cè)定要求,可用于大鼠膽汁和尿液中6種成分濃度的測(cè)定及排泄研究。無(wú)論口服知母貝母復(fù)方提取物還是單方提取物待測(cè)的6種成分在體內(nèi)都經(jīng)過(guò)了廣泛的代謝或生物轉(zhuǎn)化。不同的代謝機(jī)制導(dǎo)致了不同的排泄行為。
第四部分:
25、HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定金蓮清熱顆粒中7種成分的含量
目的:建立HPLC-MS法測(cè)定金蓮清熱顆粒中葒草苷,牡荊苷,金絲桃苷,新芒果苷,芒果苷,知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ含量的方法。
方法:取金蓮清熱顆粒,研細(xì),精密稱定粉末0.500g,置錐形瓶中,精密加入乙腈50mL,稱定質(zhì)量,超聲(功率:100W;頻率:25kHz)處理1h,放冷,再稱定質(zhì)量,用乙腈補(bǔ)充所失的重量,搖勻,離心,0.45μm濾膜濾過(guò),續(xù)濾液作
26、為供試品溶液,稀釋20倍后進(jìn)樣10μL。
質(zhì)譜色譜條件:MRM正負(fù)離子掃描模式、電噴霧離子源(ESI);正負(fù)離子在同一周期內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)換同時(shí)監(jiān)測(cè);源噴射電壓(正離子)5500V;(負(fù)離子)-4500V。離子源溫度:600℃。霧化氣(Gas1):40psi,加熱氣(Gas2):50psi,簾氣:25psi。色譜柱:C18Diamonsilcolumn(250mm×4.6mm,5μm);柱溫:30℃;洗脫程序:0-2.5min,流
27、動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(5∶95,v/v)線性變至乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v);2.5-5min,流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水(55∶45,v/v)線性變至為乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v);5-20min,乙腈-0.1%甲酸水(95∶5,v/v)下等度洗脫;最后流動(dòng)相的比例迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽畛醯囊译?0.1%甲酸水(5∶95,v/v)。每次進(jìn)樣前要預(yù)平衡6min,再進(jìn)行梯度洗脫。運(yùn)行時(shí)間:20min;流速:800μL/
28、min,進(jìn)樣量10μL。
結(jié)果:在15min內(nèi)金蓮清熱顆粒中7種主要成分峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系;加樣回收率分別為99.34%,99.28%,101.6%,101.3%,100.5%,101.9%和98.86%(n=3)。RSD值分別為1.12%,1.36%,1.57%,1.74%,1.52%,1.43%和0.92%。
結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,專屬性高,可用于金蓮清熱顆粒的質(zhì)量控制。
29、 第五部分HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定知柏地黃丸中9種成分的含量
目的:建立HPLC-MS法測(cè)定知柏地黃濃縮丸中新芒果苷,芒果苷,知母皂苷BⅡ,知母皂苷AⅢ,小檗堿,莫諾苷,馬錢苷,芍藥苷和丹皮酚含量的方法。
方法:取知柏地黃丸適量,研細(xì),精密稱定粉末0.4133g,置錐形瓶中,精密加入50%乙腈50mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率:100W;頻率:25kHz)0.5h,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%乙腈補(bǔ)足減失的重
30、量,搖勻,離心,0.45μm濾膜濾過(guò),溶液稀釋20倍后取10μL進(jìn)樣分析。
采用DiamonsilC18柱(150mm×4.6mm,5μm);柱溫30℃;乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相以800μL/min梯度洗脫;質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源正負(fù)離子模式同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)用于定量測(cè)定。
結(jié)果:在15min內(nèi)知柏地黃丸中9個(gè)有效成分峰面積與濃度線性關(guān)系良好;加樣回收率(n=3)分別為97.4
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