基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的北沙參化學(xué)成分分析與藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根,為臨床常用中藥。中國(guó)藥典記載其具有養(yǎng)陰清肺,益胃生津的功效,可用于肺熱燥咳,勞嗽痰血,熱病滓傷口渴等癥。香豆素是北沙參中的一類主要活性成分,但由于種類多樣且含量較低,使其深入研究受到限制。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)具有專屬、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn),是混合物中化學(xué)成分定性和定量分析的有力工具。本研究即采用HPLC-MS技術(shù)對(duì)

2、北沙參中的香豆素類成分進(jìn)行分析。在總結(jié)香豆素類化合物電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律的基礎(chǔ)上,采用HPLC-MS技術(shù)對(duì)北沙參中的香豆素類成分進(jìn)行定性分析;建立北沙參中15種成分同時(shí)定量的HPLC-MS分析方法,并用于不同產(chǎn)地的北沙參藥材的比較;建立生物樣品中4種藥理作用明確的香豆素類成分的HPLC-MS定量分析方法,并用于大鼠灌胃給與北沙參提取物后該4種成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　 第一部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定北沙參中的香豆素類成分
　　

3、 目的:總結(jié)香豆素類成分的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律,建立靈敏、有效的可用于鑒定北沙參中香豆素類成分的液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析方法。
　　 方法:通過(guò)電噴霧離子源正離子一級(jí)質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描,研究10個(gè)香豆素類成分對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑,并總結(jié)其規(guī)律,進(jìn)而聯(lián)合采用多離子監(jiān)測(cè)-信息依賴-增強(qiáng)型子離子掃描(MIM-IDA-EPI)和母離子掃描-信息依賴-增強(qiáng)型子離子掃描(PREC-IDA-EPI)兩種模式分析鑒定北沙參中香豆素

4、類化合物。根據(jù)母離子掃描圖中同時(shí)出現(xiàn)的[M+H]+和[M+NH4]+離子判斷未知香豆素類化合物的分子量,根據(jù)兩種模式產(chǎn)生的碎片離子信息確定化合物的結(jié)構(gòu)。采用C18柱進(jìn)行色譜分離,流動(dòng)相為1 mmol/L的醋酸銨-甲醇,梯度洗脫。
　　 結(jié)果:總結(jié)出6項(xiàng)香豆素類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律和相同取代基在C-5或C-8位的呋喃香豆素構(gòu)成的同分異構(gòu)體在RP-HPLC上的洗脫順序規(guī)律。據(jù)此鑒定出北沙參提取物中29個(gè)香豆素苷元和12個(gè)香豆素苷。

5、r>　　 結(jié)論:本法靈敏、有效,已成功用于北沙參中香豆素類化合物的鑒定。實(shí)驗(yàn)證實(shí),MIM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI掃描模式聯(lián)用技術(shù)在化合物結(jié)構(gòu)分析方面具有超過(guò)其單一模式的優(yōu)越性,對(duì)控制藥材質(zhì)量具有重要意義。
　　 第二部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定北沙參中15種成分
　　 目的:建立一種快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)測(cè)定北沙參中15種化學(xué)成分(10種香豆素類成分、4種有機(jī)酸與腺苷)的HPLC-ESI-MS分析方法,并用于

6、北沙參藥材分析。
　　 方法:由MRM-IDA-EPI模式對(duì)15種化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證,采用MRM正負(fù)離子掃描模式建立其含量測(cè)定方法,并采用所建立的方法對(duì)不同產(chǎn)地的20批北沙參藥材進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件:ESI源;正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè),10個(gè)香豆素和腺苷采用正離子模式,4種有機(jī)酸采用負(fù)離子模式;源噴射電壓(IS):5500V(正離子監(jiān)測(cè)模式),-4500 V(負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式);離子源溫度:500℃。霧化氣(Gasl):40psi,加熱氣(

7、Gas2):50 psi,簾氣:25 psi。15種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為腺苷(268.3/136.1)、東莨菪內(nèi)酯(193.1/133.0)、花椒毒酚(203.1/147.1)、花椒毒素(217.1/202.0)、補(bǔ)骨脂素(187.2/131.1)、異茴芹內(nèi)酯(247.1/232.1)、佛手柑內(nèi)酯(217.1/174.0)、氧化前胡素(287.2/203.1)、歐前胡素(271.1/203.2)、蛇床夫內(nèi)酯(301.1/233.1

8、)、異歐前胡素(271,1/147.1)、綠原酸(353.2/191.2)、咖啡酸(179.3/135.3)、香草酸(167.3/108.1)、阿魏酸(193.3/134.2)。色譜條件:色譜柱:.Agilent Zorbax SB-C18(150 min×4.6 mm,5μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:0.1％甲酸-甲醇(30:70,A:B,v/v);分析時(shí)間:11 min;流速:1.0 mL/min。
　　 結(jié)果:15種化學(xué)成

9、分在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限和定量限均符合要求。樣品測(cè)定結(jié)果表明,北沙參產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境和儲(chǔ)存時(shí)間均對(duì)15種活性成分的含量有影響,其中儲(chǔ)存時(shí)間是較為重要的影響因素。同時(shí)發(fā)現(xiàn),北沙參活性成分可能主要存在于其根部表皮中,去皮會(huì)降低其含量。
　　 結(jié)論:本法簡(jiǎn)便、快速、專屬性好,可用于北沙參中15種化學(xué)成分的含量測(cè)定,東莨菪內(nèi)酯、花椒毒酚、異茴芹內(nèi)酯、氧化前胡素為首次測(cè)定。該法對(duì)于北沙參藥材的質(zhì)量控制具

10、有重要意義。
　　 第三部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中的花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、
　　 異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯及其藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 目的:建立一種可同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手苷內(nèi)酯含量的HPLC-MS方法,并用于大鼠灌胃給與北沙參提取物后該4種成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　 方法:大鼠灌胃給與北沙參提取物(10 mL/kg)后,分別于給藥后10,30,60,90,120,15

11、0,180,210,240,270,300,360 min眼內(nèi)眥靜脈叢取血,制備血漿樣品,采用甲醇沉淀蛋白方法進(jìn)行樣品預(yù)處理,茴芹內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)。色譜柱為C18柱,流動(dòng)相為1 mmol/L醋酸銨-甲醇(30:70,v/v),運(yùn)行時(shí)間為6 min。采用電噴霧離子源(ESI),正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)。4種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為花椒毒素m/z217.1/202.1,補(bǔ)骨脂素m/z187.1/131.1,異茴芹內(nèi)酯m/z2

12、47.1/217.0,佛手苷內(nèi)酯m/z217.1/202.1和茴芹內(nèi)酯m/z247.1/231.1。
　　 結(jié)果:血漿中花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯分別在0.680～680、1.21～1210、0.800～800和0.464～464 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.998),最低定量限(LLOQ)≤1.21 ng/mL。日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于9.7％,相對(duì)誤差(RE)為－8.1％～4.