基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的麥冬化學(xué)成分分析與藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、麥冬為百合科植物麥冬[Ophiopogon japonicus(L.f.)Ker-Gawl]的干燥塊根，屬臨床常用滋陰中藥。本研究即采用LC-MS技術(shù)對麥冬中化學(xué)成分進(jìn)行了分析，并研究其藥代動(dòng)力學(xué)特征:鑒定了麥冬中皂苷和黃酮類成分，總結(jié)其電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律;建立麥冬和山麥冬中11種成分的含量測定方法，并用于不同產(chǎn)地的麥冬和山麥冬藥材的比較;建立大鼠生物樣品中麥冬黃酮和皂苷類成分的LC-MS定量分析方法，用于大鼠灌胃給與麥冬提取物后的藥物

2、動(dòng)力學(xué)研究，并鑒定大鼠尿液、膽汁和血液中的麥冬皂苷、黃酮及其代謝產(chǎn)物，初步探索麥冬提取物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 麥冬中皂苷和黃酮類成分的鑒定
　　目的:總結(jié)麥冬皂苷和麥冬黃酮類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，采用UPLC-Q-Tof-MS/MS技術(shù)，建立快速、高效的麥冬主要成分的鑒定方法。
　　方法:通過電噴霧離子源正、負(fù)離子一級質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描，研究9個(gè)麥冬化學(xué)成分對

3、照品的質(zhì)譜裂解途徑，并總結(jié)規(guī)律。采用 UPLC-Q-Tof-MS/MS技術(shù)對麥冬乙醇提取液進(jìn)行Tof-MS-IDA-8MS/MS掃描，獲取全掃描質(zhì)量色譜圖，采用Peak View2.0數(shù)據(jù)處理軟件中“Master View”、“Formular Finder”等分析功能，通過分析化合物保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、元素組成、同位素豐度和一級、二級質(zhì)譜圖，篩選和鑒定麥冬中化學(xué)成分。色譜條件:Kinetex XB-C18色譜柱（100 mm×2.

4、1 mm i.d.2.6μm）;柱溫:25℃;流動(dòng)相:乙腈-1‰乙酸水，梯度洗脫;流速:0.4 mL/min。進(jìn)樣量:5μL。
　　結(jié)果:總結(jié)出麥冬中9種化學(xué)成分（4個(gè)甾體皂苷、5個(gè)高異黃酮類化合物）的11項(xiàng)質(zhì)譜裂解規(guī)律。據(jù)此采用UPLC-Q-Tof-MS/MS技術(shù)鑒定出麥冬提取物中30種化學(xué)成分（包括12個(gè)甾體皂苷、18個(gè)高異黃酮類類化合物），其中9種化合物與對照品比對可確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)，其余21種化合物通過分析元素組成、同位素豐

5、度和一級、二級質(zhì)譜圖可被鑒定，誤差范圍在±5 ppm之內(nèi)。
　　結(jié)論:所建方法簡便快捷、靈敏度高，可用于麥冬有效成分的定性分析，為麥冬藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。
　　第二部分 麥冬與山麥冬中11種化學(xué)成分的測定與比較
　　目的:建立LC-MS/MS方法同時(shí)測定麥冬及山麥冬藥材中6種皂苷和5種黃酮類成分，并結(jié)合含量百分比柱狀圖與聚類分析對不同產(chǎn)地的麥冬和山麥冬進(jìn)行了比較。
　　方法:采用Phenomenex Lu

6、na C18(2)柱(150×2.00 mm，5μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:乙腈-1‰乙酸-水，梯度洗脫;流速:0.8 mL/min。進(jìn)樣量:10μL。采用電噴霧離子化源(ESI)及多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行正負(fù)離子切換檢測。源噴射電壓（正離子）5500 V;（負(fù)離子）-4500 V;霧化溫度為600℃;霧化氣(GS1，N2):4.14×105 Pa;輔助氣(GS2，N2):4.48×105 Pa;氣簾氣(N2):1.72×10

7、5 Pa。11種被測成分的監(jiān)測離子對分別為m/z719.5/393.3(麥冬皂苷Ra)、851.6/393.3(Ophiopojaponin C)、m/z855.8/287.3（麥冬皂苷D）、m/z855.8/253.4(麥冬皂苷D')、m/z872.3/413.5(短葶山麥冬皂苷C)、m/z723.6/269.3(山麥冬皂苷B)、m/z361.2/237.8(麥冬黃烷酮E)、m/z341.1/178.0(麥冬二氫黃烷酮A)、m/z32

8、7.1/178.0(麥冬二氫黃烷酮B)、m/z355.0/193.2（麥冬黃烷酮C）、和m/z339.0/217.8(麥冬黃酮A)。用所建立的方法對不同來源的53批麥冬及山麥冬進(jìn)行分析（包括16批麥冬、19批短葶山麥冬、9湖北山麥冬和9批麥冬和短葶山麥冬的混合品）。
　　結(jié)果:所測11種成分在測定濃度區(qū)間線性關(guān)系良好，r2＞0.9915;日內(nèi)和日間精密度分別小于3.7％和4.2％;平均回收率95.3％～106.7％;穩(wěn)定性、檢測限

9、和定量限均符合要求。樣品測定結(jié)果表明，麥冬富含皂苷和黃酮兩類物質(zhì)，而山麥冬皂苷類成分含量較高，黃酮含量極低。黃酮類化合物可能成為區(qū)別麥冬和山麥冬的重要標(biāo)志。運(yùn)用聚類分析成功區(qū)分麥冬和山麥冬藥材，不同產(chǎn)地的麥冬化學(xué)成分差異較大，而山麥冬差異較小。
　　結(jié)論:該法簡便快捷，選擇性好，靈敏度高，可用于麥冬及山麥冬中11中化學(xué)成分的含量測定，本法為麥冬及山麥冬藥材的質(zhì)量分析與評價(jià)提供了有意義的依據(jù)和補(bǔ)充。
　　第三部分 麥冬中5種成

10、分在大鼠血漿中的藥物動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:建立可同時(shí)測定大鼠血漿中麥冬皂苷D、麥冬黃烷酮E、麥冬黃酮A、麥冬二氫黃烷酮A和麥冬二氫黃烷酮B含量的UPLC-MS/MS方法，并用于大鼠灌胃給與麥冬提取物后該5種成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　方法:大鼠灌胃給與麥冬提取物后，分別于給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36h大鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，制備血漿，采用乙腈沉淀蛋白后進(jìn)行分析，以補(bǔ)骨脂素作為內(nèi)標(biāo)。乙腈-0.

11、3‰乙酸水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.4 mL/min，色譜柱為Kenetix C18柱(50 mm×3mm，2.6μm)，柱溫25℃。采用電噴霧離子(ESI)源，MRM及正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測模式。進(jìn)樣量:10μL。
　　結(jié)果:本法屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于大鼠灌胃給與麥冬提取物后血漿中麥冬皂苷D、麥冬黃烷酮E、麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的藥代動(dòng)力學(xué)研究。血漿中麥冬黃烷酮E、麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷

12、酮A和甲基麥冬黃烷酮B在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性范圍(r＜0.9931)。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明，所測麥冬黃酮類成分雖具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)卻表現(xiàn)顯著差異，而麥冬皂苷D的血藥濃度較低，推測可能口服吸收較差。
　　結(jié)論:建立了一種靈敏度高、專屬性強(qiáng)的UPLC-MS法測定大鼠血漿中麥冬皂苷D、麥冬黃烷酮E、麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B，并用于這些物質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　第四部分 麥冬中8

13、種成分在大鼠膽汁和尿液中的排泄動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:建立UPLC-MS法測定大鼠口服麥冬提取物后尿液中8種化合物的濃度，膽汁中4種化合物的濃度;并用于其尿液和膽汁的排泄學(xué)研究。
　　方法:色譜柱為KenetixC18柱(50mm×3mm，2.6μm)，柱溫25℃;流動(dòng)相為乙腈A-0.3‰乙酸水溶液B，梯度洗脫，洗脫程序如下:0-3min，40-50％A;3-6min，50-90％A，流速為0.4mL/min，進(jìn)樣量:5μL。

14、電噴霧離子源（ESI源），源溫度600℃。采用正負(fù)離子同時(shí)檢測，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描。SD大鼠12只，隨機(jī)分成兩組，每組6只，分別灌胃給予麥冬提取物后，一組收集給藥后0-1h，1-3h，3-5h，5-7h，7-9h，9-12h和12-24h時(shí)間段膽汁并記錄體積，一組收集給藥后0-4h，4-8h，8-12h，12-24h，24-36h，36-48h，48-60h和60-72h時(shí)間段尿液并記錄體積。用所建方法測定大鼠灌胃給與麥冬提

15、取物后尿液和膽汁中麥冬皂苷和麥冬黃酮的累積排泄量。
　　結(jié)果:大鼠尿液和膽汁中內(nèi)源性物質(zhì)不影響8種被測物和內(nèi)標(biāo)的測定。尿液中8種被測成分線性良好(r＞0.9947)，日內(nèi)和日間RSD均小于11.9％，提取回收率均大于63.2％，基質(zhì)效應(yīng)為87.3％-105.7％。膽汁中4種所測成分線性良好(r＞0.9956)，日內(nèi)和日間RSD均小于10.4％，提取回收率均大于68.9％，基質(zhì)效應(yīng)為84.5％-103.6％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明尿液和膽汁中

16、原型物質(zhì)累積排泄量遠(yuǎn)小于給藥量，提示所測成分在體內(nèi)可能經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了大量的代謝物。
　　結(jié)論:本研究首次測定了大鼠灌胃麥冬提取物后尿液中8種組分和膽汁4種組分。該法簡便，靈敏，可滿足生物樣品中微量麥冬皂苷和黃酮類化合物的測定要求，對麥冬的進(jìn)一步物質(zhì)基礎(chǔ)研究有重要意義。
　　第五部分 麥冬在大鼠體內(nèi)的吸收組分及其代謝物鑒定
　　目的:建立UPLC-Q-Tof-MS/MS技術(shù)鑒定大鼠灌胃麥冬提取物后尿液、膽汁和血漿中麥

17、冬皂苷和黃酮類成分及其代謝物的方法，探索麥冬主要活性物質(zhì)的體內(nèi)代謝途徑。
　　方法:色譜條件:Kinetex XB-C18色譜柱（100 mm2.1 mm i.d.2.6μm）;柱溫:25℃;流動(dòng)相為乙腈(A)-1‰乙酸-水(B)，梯度洗脫;流速:0.4 mL/min。進(jìn)樣量:5μL。SD大鼠灌胃麥冬提取物后，收集0-24h尿液，0-24h膽汁和0-12h血樣制備含藥樣品，并與相同條件下空白生物樣品及藥材提取物圖譜對比，采用Pea

18、k View2.0和Metabolite Pilot數(shù)據(jù)處理軟件，通過分析化合物保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、元素組成、同位素豐度和一級、二級質(zhì)譜圖，篩選和鑒定尿液中麥冬皂苷和黃酮類成分及其代謝物。
　　結(jié)果:建立了大鼠灌胃麥冬提取物后尿液、膽汁和血漿中麥冬活性物質(zhì)及其代謝物的鑒定方法，共鑒定出19個(gè)原型成分和20個(gè)代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)論:本研究所建方法簡便高效，為麥冬藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了依據(jù)。皂苷類化合物未發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物，黃酮類