基于液質聯(lián)用技術的當藥多組分分析與藥代動力學研究.pdf

1、中國傳統(tǒng)醫(yī)學（中醫(yī)）已用于臨床實踐了幾千年。在中醫(yī)治療體系中，中藥對疾病的預防和治療起著不可或缺的作用，尤其是復雜和慢性病的治療。Swertia pseudochinensis（在中國稱為當藥），中藥的重要成員，是獐牙菜Swertia pseudochinensis Hara的干燥全草，并已被列入中國人民共和國2010年的藥典。當藥屬龍膽科獐牙菜屬藥材，在中國現(xiàn)已被用于治療消化功能減退，急性和慢性痢疾，肝炎。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的當藥具有眾多的藥理

2、作用，已被發(fā)現(xiàn)的有健胃，利膽，保肝，解熱作用。在國內當藥主要用于當飛利肝寧膠囊的生產制備。當藥中的主要活性成分包含的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類，黃酮類和氧雜蒽酮類等。本實驗中對獐牙菜苦苷、當藥苷、龍膽苦苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷同時測定。建立并驗證了一種快速準確的LC-MS/MS方法同時測定該6種分析物。對中藥采用HPLC-MS-MS并結合化學計量技術對生物活性成分同時定量是一種可靠的方法，對當藥的全面控制質量具有重要作用。
　　為闡明

3、天然產物和中藥(TCM)的活性成分的體內作用機制，藥代動力學研究是必不可少的。由于中藥的療效是基于多種成分間復雜的相互作用，當藥提取物給藥后多組分的藥代動力學研究的研究是必不可少的。本實驗開發(fā)和驗證了一種新的大鼠血漿中同時分析獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷的LC-MS/MS方法。該分析方法已成功應用于口服當藥提取物后多個活性成分的藥代動力學研究。
　　當藥苷（C16H22O9，分子量358.344），環(huán)烯

4、醚萜苷，廣泛存在于獐牙菜屬植物中并表現(xiàn)出多種的藥理學和生物學活性。現(xiàn)代藥理表明當藥苷具有許多的藥理學和生物活性，其中包括保肝作用，抗增殖，血管舒張，抗肝損傷，抗炎和抗過敏等作用。在本項研究中，開發(fā)了一種高性能的液相色譜-串聯(lián)質譜法與電噴霧電離（HPLC-ESI-MS/MS）方法并成功地應用于當藥苷的大鼠生物樣品如血漿，組織，膽汁，尿液和糞便中的定量。本實驗研究了在健康SD大鼠中當藥昔的藥代動力學，組織分布和排泄研究，并進行了單次口服（三

5、個劑量）給藥和靜脈給藥當藥苷后的藥動學研究。當藥苷的大鼠體內藥代動力學、分布和排泄方面的研究將為合適的劑型設計和臨床的合理用藥提供有用的信息。
　　第一部分、液質聯(lián)用法同時測定當藥中6種成分的含量
　　目的:建立一種高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)，對當藥中的環(huán)烯醚萜類和黃酮苷進行體外定量，被測成分為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷。
　　方法:色譜柱:Diamonsi

6、l C18（迪馬公司，150mm×4.6mm，5μm），柱溫度保持在30℃，進樣量為20μL。流動相:A（甲醇）和B（0.1％甲酸，V/V），使用梯度洗脫如下:0-4.5 min，45％A～70％A;4.5-4.6 min，70％A～95％A;4.6-10.0 min，95％A;再快速返回初始比例A-B(45∶55，V/V)。后運行時間6min。液相流量設定為0.8mL/min。總運行時間為10.0min。采用正負離子同時監(jiān)測的多反應監(jiān)

7、測(MRM)模式對樣品進行定量分析。離子噴霧電壓為5500和-4500V，源溫度(TEM)650℃;霧化氣(GS1，N2)60 psi，輔助氣(GS2，N2)65 psi，氣簾氣(N2)25 psi。
　　結果:該方法具有較高的敏感度和特異性，成功應用于同時測定當藥中的活性成分。6種被測成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內均具有良好的線性關系，檢測限、定量限、精密度和穩(wěn)定性均符合要求。標準曲線的相關系數(shù)均高于0.995。日內和日間的

8、精密度(RSD)分別小于2.39％和3.47％。平均回收率在96.5％-105.1％之間。被分析成分48h內穩(wěn)定性良好。該方法已成功地應用于不同產地來源的30批次的當藥樣品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷的定性和定量分析。該結果表明，環(huán)烯醚萜類成分是當藥中的主要活性成分（尤其是獐牙菜苦苷和當藥苷）
　　結論:實驗結果表明，LC-ESI-MS/MS方法適用于當藥體外定量的常規(guī)分析，對當藥的質量控制提供了全面

9、可靠的方法。
　　第二部分、液質聯(lián)用法同時測定大鼠血漿中3種環(huán)烯醚萜類及3種黃酮類成分及其藥代動力學研究
　　目的:建立和驗證一種LC-MS/MS方法在大鼠體內同時測定獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷，并成功應用于口服給藥當藥提取物后大鼠藥代動力學研究。
　　方法:采用反相Diamonsil C18柱(150×4.6mm，5μm)，柱溫為30℃。洗脫劑A（甲醇）和B（0.1％甲酸水;V/V）的線

10、性梯度洗脫。使用以下梯度條件:初始0-4.5min，45％A～70％A;4.5-4.6 min，70％A～95％A;4.6-10min，等度洗脫95％A。ESI源操作條件如下:離子噴霧電壓為5500和-4500伏，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(GAS1)和加熱氣(GAS2)分別設定為60和65 psi。簾氣保持在25 psi，接口加熱。全程通入氮氣。當藥（100克）的干燥粉末70％乙醇回流提取三次(1∶20，1∶20，1∶10 w/

11、v)，每次60min?？诜o藥當藥提取物（4mL/kg）后大鼠眼內眥取血約0.3 mL，血液樣品被收集在含有肝素的離心管中。血樣采集時間為0（給藥前），5，10，25，40，60，75，105，150，240和360 min。將血液樣品以4000rpm離心10分鐘，取上清50μL轉移到清潔的離心管中，于-20℃保存。血漿樣品處理采用液液萃取方法(LLE)，樣品處理后通過HPLC/MS方法對環(huán)烯醚萜類成分、黃酮類成分及IS進行分析。

12、>　　結果:線性參數(shù)和6種的被分析物的LLOQ表明，各化合物在試驗范圍濃度內線性關系良好。所有標準曲線的相關系數(shù)均高于0.99。對QC樣品在三個濃度下進行測定，日內和日間精密度和準確度良好。各成分提取回收率介于76.2％和102.5％之間，基質效應介于86.2％和102.6％之間。被分析物穩(wěn)定性良好。在大鼠血漿藥代動力學研究中，被測組分被分成兩組:環(huán)烯醚萜苷和黃酮苷類。應用非房室模型來計算的該實驗的藥代動力學參數(shù)。在環(huán)烯醚萜類物質中，當

13、藥苷在10min即達到最高血藥濃度，而獐牙菜苦苷和龍膽苦苷則在40min。在黃酮類物質中，芒果苷、異葒草苷和異牡荊苷的達峰時間均為25min。獐牙菜苦苷、當藥苷、龍膽苦苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷的AUC0→t分別為94640.7、38828.4、82181.3、13425.6、3296.31和811.318 ng min/mL。無論是當藥藥材中的含量或大鼠血漿中的AUC的對比均發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類成分遠高于黃酮苷類成分。這表明，當藥中黃酮

14、苷類的生物利用度明顯低于環(huán)烯醚萜類成分。總的來看，當藥中6中被測活性成分在大鼠體內迅速吸收，在5 min處均可檢測到，隨后快速吸收達到最大濃度，最終在口服給藥360 min后血藥濃度降低至定量限附近。
　　結論:本實驗首次建立了一種新型LC-MS/MS方法對大鼠血漿中的獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷同時定量研究。本實驗通過簡潔的方法對樣品進行處理并在較短時間內完成分析。該分析方法已成功應用于口服給藥當藥苷

15、提取物后被分析物的藥代動力學研究。其結果對當藥作用機理的進一步研究有所幫助，并可為該中藥的臨床應用提供有效參考。
　　第三部分、液質聯(lián)用法測定大鼠血漿中當藥苷單體的含量及藥代動力學特征、組織分布和排泄研究
　　目的:開發(fā)和驗證一種HPLC-MS方法分析大鼠血漿、組織、膽汁、尿液和糞便中的當藥苷。
　　方法:色譜分離采用Diamonsil C18柱（迪馬公司，150mm×4.6mm，5μm）進行。該柱溫度保持在30℃，進

16、樣量為20μL。流速設定為0.8mL/min。為了減少污染流入離子源，排出前2 min的洗脫液。使用ESI源，使用以下條件在正離子模式下運行:電壓為5500V，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(GAS1)和加熱氣(GAS2)分別設定為60和65 psi。簾氣為25 psi，接口加熱。CXP和EP被設定為5.0 V和10.0 V。多反應監(jiān)測（MRM）模式下進行測定。當藥苷和獐牙菜苦苷(IS)使用的離子對分別為m/z359.1-m/z197

17、.2和m/z397.4-m/z165.3。離子對的滯留時間(dwell time)設定為200ms。在當藥苷的藥動學研究中，大鼠在三種劑量（5，10，15 mg/kg）下進行口服給藥以及1 mg/kg單一劑量下進行靜脈注射給藥，將SD大鼠隨機分為4組（每組6只）用于口服及靜脈注射給藥?？诜o藥后分別在5，15，30，45，60，90，120，180，270，360，540，720min時間點處眼內眥取血，靜脈注射給藥后則在5，10，20

18、，30，45，60，75，90，120，150min時間點處取血。將血液樣品立即轉移到肝素化管中，并以4000rpm離心5分鐘。將上層血漿轉移到清潔的離心管中，于-20℃保存。在當藥苷組織分布的研究中，大鼠隨機分為4組(n=5)?？诜o藥當藥苷單體10 mg/kg后，分別在30，60，120min和6h時間點處收集心臟，肝，肺，脾，腎和腦樣品。在膽汁排泄研究中，口服給藥當藥苷單體10 mg/kg后，分別在0-0.5，0.5-1，1-2，

19、2-3，3-4，4-5，5-6，6-8，8-12和12-24h時間段收集膽汁，量取膽汁體積，并保存于-20℃。在尿液和糞便排泄研究中，尿液和糞便分別在0-2，2-6，6-12，12-24，24-36和36-48 h時間段收集。在本研究中，采用常規(guī)蛋白沉淀法用于各生物樣品（血漿、組織勻漿、尿液、糞便和膽汁）中當藥苷和IS的提取。
　　結果:各標準曲線的相關系數(shù)均大于0.992。日內和日間精密度值(RSD，％)均小于11.2％，準確度

20、(RE，％)介于-10.56和13.47％之間。當藥苷在各基質中的提取回收率在76.12-89.21％之間。不同基質中當藥苷的基質效應均在80％-120％之間。穩(wěn)定性結果表明，該當藥苷定量方法在大鼠各基質中穩(wěn)定性良好。本實驗中HPLC-MS方法已成功應用于當藥苷單劑量口服給藥（5，10，15 mg/kg）和靜脈注射給藥（1 mg/kg）的藥代動力學研究中。應用非房室模型進行藥動學參數(shù)計算。由口服給藥和靜脈注射給藥AUC對比得出當藥昔的絕

21、對生物利用度（F％）為11.9±1.33％。藥代動力學研究表明，當藥苷能在大鼠體內快速達到Cmax，隨后快速消除，這暗示當藥苷在體內的藥理作用起效較快，作用時間較短。當藥苷三種口服劑量（5，10，15 mg/kg）下的AUC0-。。分別為39673.2 ngmin/mL，71983.6 ng min/mL和113578 ng min/mL。說明當藥苷口服劑量和大鼠體內吸收成線性關系。因此，本研究結果表明，當藥苷在所研究劑量范圍內呈線性的

22、藥代動力學特征。在組織分布研究中發(fā)現(xiàn)，當藥苷可快速廣泛的分布至各個組織。結果表明，當藥苷主要分布器官為腎，肝，脾，肺，此外還有少量的藥物可以滲透到心臟和腦組織。由此看出當藥苷主要分布于供血豐富組織，這意味著器官的血流量或灌注率是影響當藥苷分布的關鍵因素。而在大腦中的可檢測的少量的當藥苷表明其能穿越血-腦屏障(BBB)。當藥苷在膽汁、尿液和糞便中的排泄數(shù)據顯示僅有2.678％（膽汁0.674％，尿液1.546％，糞便0.458％）的當藥苷

23、以原型排出。由于具有良好的水溶性，當藥苷可以快速通過腎小管排泄，因此主要的排泄途徑為尿液。當藥苷在膽汁中的低排泄率說明只有少量當藥苷原型藥物由膽汁排泄，這可能是由于肝臟首過效應或其他代謝過程所導致的。以上結果表明，當藥苷主要通過轉化成其他代謝產物進行排泄。
　　結論:本實驗首次對大鼠口服及靜脈給藥當藥苷后的藥代動力學，組織分布和排泄進行研究。建立了一種快速、可靠、靈敏的HPLC-MS方法對大鼠生物樣品如血漿、尿液、膽汁、糞便和組織