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文檔簡介
1、本研究首先建立了同時測定蛇床子中16種活性成分的LC-ESI-MS/MS分析方法,該方法可用于蛇床子藥材的全面質(zhì)量控制,提高了蛇床子藥材的質(zhì)量控制水平;在本研究中,還建立了靈敏度高,專屬性強(qiáng)的UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠血漿樣品中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素等6種香豆素類活性成分,并將該方法應(yīng)用于大鼠灌胃給予蛇床子提取物后血漿中6種成分的藥代動力學(xué)研究,為中藥材蛇床子的臨床應(yīng)用提供參考依
2、據(jù);還建立了同時測定八子補(bǔ)腎膠囊中14種活性成分的UPLC-ESI-MS/MS定量分析方法,并應(yīng)用于八子補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量控制;建立了同時測定蛇床子中7種香豆素類活性成分的GC-MS-SIM定量分析方法,為中藥材蛇床子的質(zhì)量控制提供新的分析手段;采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析技術(shù),對大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯后尿液和膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定研究,推測出佛手柑內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律和主要代謝途徑,為佛手柑內(nèi)酯的臨床應(yīng)用提供重要參
3、考。本文主要從以下幾部分展開論述:
第一部分 HPLC-ESI-MS/MS法同時測定蛇床子中16種活性成分的含量及其質(zhì)量表征
目的:建立一種快速、準(zhǔn)確的LC-ESI-MS/MS定量分析方法,可同時分離、測定不同來源的蛇床子藥材中16種活性成分(9種香豆素類,包括蛇床子素、花椒毒酚、異補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒素、二氫歐山芹素、歐前胡素和異歐前胡素;7種黃酮類,包括山奈酚、異鼠李素、槲皮苷、木犀草素、槲皮
4、素、橙皮苷和蘆?。?,并用于12批不同來源蛇床子藥材的質(zhì)量分析。
方法:液相色譜柱Waters XBridge C18柱(250×4.6 mm,5μm);流動相為A:乙腈,B:水(含有0.1%乙酸),梯度洗脫,分析時間為15 min,流速為1.0 mL/min。質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI源),TurboV離子源,源溫度(TEM)550℃,采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM),進(jìn)行正負(fù)離子同時檢測。源噴射電壓(IS)為4500 V和-4
5、500 V,霧化溫度為650℃,霧化氣(GS1,N2)為50 psi,輔助氣(GS2,N2)為60 psi,氣簾氣(N2)為25 psi。接口持續(xù)加熱,全程氮?dú)馔ㄈ霠顟B(tài)。每個離子對的滯留時間為40 ms。DP為10/-10 V;CXP為5/-5 V。全掃描相對分子量范圍為100~1000。
結(jié)果:16種活性成分的線性關(guān)系良好(r2≥0.9987),檢測限和定量限分別為1.71~7.29 ng/mL和5.10~20.01 ng/
6、mL。日內(nèi)日間精密度分別為0.5~3.6%和0.6~3.5%。穩(wěn)定性和重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.5~3.9%和0.5~3.2%。平均回收率范圍在96.89%~101.6%。
結(jié)論:本研究首次建立了HPLC-ESI-MS/MS法,采用在一個分析周期內(nèi)正負(fù)離子多次切換的檢測模式,同時定性和定量分析蛇床子藥材中16種有效成分,并將該方法應(yīng)用于12批不同來源藥材的質(zhì)量分析,該方法操作簡便、快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng),可為蛇床子藥材的
7、質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。從樣品的含量測定結(jié)果來看,各產(chǎn)地之間12批次蛇床子藥材的質(zhì)量差異大,提示藥材質(zhì)量受產(chǎn)地及其種植地天氣狀況等的影響。因而有必要對藥材的產(chǎn)地及采集等進(jìn)行跟蹤檢測,以保證蛇床子藥材質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定。
第二部分 UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠口服蛇床子提取物后血漿中6種成分及藥代動力學(xué)研究
目的:建立一種同時測定大鼠血漿中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素等6種
8、香豆素類化合物含量的UPLC-ESI-MS/MS方法,成功的應(yīng)用于大鼠灌胃給予蛇床子提取物后血漿中6種成分的藥代動力學(xué)研究,并建立其藥-時曲線,闡明藥動學(xué)參數(shù)與特征。
方法:大鼠灌胃給與蛇床子提取物(6 mL/kg)后,分別于給藥后0.08,0.17,0.33,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,9,12,18,24和30 h眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.3 mL,制備血漿樣品,采用甲醇直接沉淀蛋白法進(jìn)行樣品預(yù)處理,磺胺甲噁唑
9、為內(nèi)標(biāo)。
結(jié)果:大鼠口服灌胃給予蛇床子提取物后,血漿中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素等6種待測成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)藥-時曲線有所差異,其中,歐前胡素吸收最快,達(dá)峰時間為給藥后1 h;異歐前胡素在給藥后1.5 h達(dá)到最高血藥濃度;花椒毒素達(dá)峰時間為給藥后2h左右;異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯吸收稍慢,達(dá)峰時間為給藥后3 h;蛇床子素吸收最慢,于給藥后6h達(dá)到血漿峰濃度??傮w來說,大鼠灌胃給予蛇床
10、子提取物后,6種待測成分在體內(nèi)吸收均較迅速,5 min均可檢測到,并且具有相近的消除速率。
結(jié)論:本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠血漿中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素的含量,并應(yīng)用于蛇床子中6種活性成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。該方法操作簡單、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高,對蛇床子藥材的體內(nèi)定量分析具有重要意義,有益于傳統(tǒng)中藥蛇床子的臨床應(yīng)用。
第三部分 UPLC
11、-ESI-MS/MS法測定八子補(bǔ)腎膠囊中14種成分含量
目的:建立UPLC-ESI-MS/MS法測定八子補(bǔ)腎膠囊中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、異歐前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金絲桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、異鼠李素和熊果酸等14種成分的含量。
方法:取八子補(bǔ)腎膠囊20粒,傾出內(nèi)容物,研細(xì),混勻,取粉末約4.00 g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入70%乙醇80 mL,精密稱定,超聲(
12、功率:100W;頻率:25kHz)處理60 min,放冷,再精密稱定,用70%乙醇補(bǔ)充損失的重量,搖勻,離心,用0.2μm濾膜濾過,續(xù)濾液作為供試品溶液,負(fù)離子模式直接進(jìn)樣2μL,正離子模式稀釋40倍后進(jìn)樣2μL。
結(jié)果:在5min內(nèi)八子補(bǔ)腎膠囊中14種主要成分實現(xiàn)良好分離,峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(r2≥0.9989);花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、異歐前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金絲桃苷、槲
13、皮苷、木犀草素、山奈酚、異鼠李素和熊果酸加樣回收率分別為99.56%,99.47%,99.69%,101.2%,99.89%,100.2%,99.86%,101.2%,98.69%,101.1%,98.65%,99.75%,101.9%和97.89%(n=3)。RSD值分別為1.1%,0.9%,1.3%,1.1%,1.5%,1.4%,1.4%,0.8%,1.7%,1.7%,1.9%,1.5%,1.6%和2.1%。
結(jié)論:該方法
14、操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好,專屬性強(qiáng),可用于八子補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量控制。
第四部分 GC-MS-SIM法同時測定蛇床子中7種香豆素類活性成分的含量
目的:建立一種快速、準(zhǔn)確的GC-MS-SIM定量分析方法,同時分離、測定不同來源的蛇床子藥材中異補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、異茴芹內(nèi)酯、歐前胡素和二氫歐山芹醇等7種香豆素類活性成分的含量,并應(yīng)用于12批不同來源蛇床子藥材的質(zhì)量分析。
方法:控制
15、色譜柱參數(shù)分析樣品。
結(jié)果:7種香豆素類活性成分的線性關(guān)系良好(r2≥0.9986),檢測限和定量限分別為1.06~10.11 ng/mL和3.21~29.88 ng/mL。日內(nèi)日間精密度分別為0.7~2.5%和1.2~3.3%。穩(wěn)定性和重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.5~2.5%和0.8~3.0%。平均回收率范圍為92.38%~100.53%。
結(jié)論:本研究首次建立了GC-MS-SIM法,同時定性和定量分析蛇床子藥材
16、中7種香豆素類有效成分,并將該方法應(yīng)用于12批不同來源藥材的質(zhì)量分析,該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好,可為蛇床子藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。從樣品的含量測定結(jié)果來看,各產(chǎn)地之間12批次蛇床子藥材的質(zhì)量差異大,提示藥材質(zhì)量受產(chǎn)地及其種植地天氣狀況等的影響。因而有必要對藥材的產(chǎn)地及采集等進(jìn)行跟蹤檢測,以保證蛇床子藥材質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定。
第五部分 UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析佛手柑內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物
17、目的:建立一種UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法,對大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯后尿液和膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定研究,推測佛手柑內(nèi)酯在體內(nèi)的代謝規(guī)律和主要代謝途徑。
方法:大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯,收集給藥前后的尿液和膽汁,采用Waters Ostro96孔板法處理樣品。
結(jié)果:尿液和膽汁中共發(fā)現(xiàn)佛手柑內(nèi)酯大鼠體內(nèi)可能的代謝產(chǎn)物17個,其中尿液中有17個,膽汁中有16個,膽汁中的16個代謝產(chǎn)物在尿液中均被發(fā)現(xiàn)。佛手
18、柑內(nèi)酯在膽汁和尿液中的Ⅰ相代謝產(chǎn)物有6個,主要為雙鍵氧化,氧化脫甲基,水解等;Ⅱ相代謝產(chǎn)物有11個,主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。佛手柑內(nèi)酯在尿液和膽汁中的代謝物種類并無明顯差異,只是代謝物的含量不同。
結(jié)論:本研究首次建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS法,對大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯后尿液和膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定研究,推測出佛手柑內(nèi)酯在體內(nèi)的代謝規(guī)律和主要代謝途徑。該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好,可用于體內(nèi)微量成
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