香連丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其活性組分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、香連丸是由黃連和木香組成的復(fù)方制劑，具有清熱化濕，行氣止痛的功效，主治濕熱痢疾、里急后重、腹痛泄瀉、菌痢、腸炎。方中黃連占80％，為主藥；木香則起重要的輔助作用；吳茱萸制黃連抑制黃連苦寒之性，使其寒而不滯。近年來(lái)關(guān)于香連丸的質(zhì)量研究以小檗堿的含量測(cè)定為主。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，單單以一種活性組分的含量對(duì)中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代中藥發(fā)展的需要。為了提升中藥復(fù)方制劑香連丸的質(zhì)量控制水平，我們對(duì)香連丸中三種生物堿和兩種倍半萜

2、內(nèi)酯類化合物進(jìn)行了含量測(cè)定研究，并建立了香連丸中生物堿類成分的指紋圖譜，以期為全面控制香連丸的質(zhì)量提供方法基礎(chǔ)。眾所周知，中藥之所以具有豐富的活性，依賴于其豐富的活性組成成分，這些活性組分的體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究可以為其活性作用機(jī)理的闡釋提供理論基礎(chǔ)，為其臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)；目前尚未見香連丸中活性組分的體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究的報(bào)道。鑒于此，我們對(duì)來(lái)自于香連丸的兩種中藥活性倍半萜內(nèi)酯-木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了

3、研究；并詳細(xì)研究了這兩種活性組分在小鼠各組織中的分布。另外，為了給體內(nèi)過(guò)程研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，我們建立了木香中的活性成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的反相高效液相(RP-HPLC)半制備方法。
　　 主要研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)方面：
　　 一.香連丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
　　 1.建立了香連丸中三種季胺型生物堿巴馬汀、藥根堿和小檗堿含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相膠束色譜，Kromasil ODS(5μm，4.6 mm×150

4、 mm)色譜柱，流動(dòng)相：0.2 mol.L-1NaH2PO4水溶液-7.00 mmol.L-1十二烷基硫酸鈉-乙腈(35∶35∶30，V∶V∶V)，流速1.0 mL.min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。香連丸中小檗堿、藥根堿和巴馬汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為A=3.37×104X-2.65×104(r=0.9999)，A=4.58×103X-2.88×103(r=0.9997)，A=5.62×103X-9.46×103(r=0.999

5、4)；平均回收率分別為87.67％(RSD=0.17)，102.37％(RSD=0.98)，96.81％(RSD=3.13)。按照該方法測(cè)定了市售及自制香連丸中小檗堿、藥根堿和巴馬汀的含量，結(jié)果顯示它們的平均含量分別為45.77 mg.g-1，3.89 mg.g-1，9.88 mg.g-1(佛慈藥廠)；86.53 mg.g-1，16.66 mg.g-1，18.59 mg.g-1(自制香連丸)。
　　 2.建立了香連丸中兩種倍半萜

6、內(nèi)酯-木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜，Hypersil ODS(5μm，4.6mm×250mm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水(70∶30，V∶V)，流速1.0 mL.min-1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm測(cè)定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量。其標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別為A=1.30×105X-3.38×104(r=0.9998)，0.0223～0.178 mg.ml-1；A=1.68×105

7、 X-3.34×104(r=0.9993)，0.023～0.182 mg.ml-1；平均回收率為98.50％(RSD=0.53)，95.30％(RSD=0.32)。市售香連丸中的平均含量為：1.23mg.g-1，1.17 mg.g-1；自制香連丸中的平均含量為：2.41 mg.g-1，2.13 mg.g-1；實(shí)驗(yàn)還對(duì)組方藥材-木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯進(jìn)行了含量測(cè)定，經(jīng)測(cè)得，其平均含量為：14.93 mg.g-1，13.16 mg

8、.g-1(惠仁堂)；15.67 mg.g-1，11.19 mg.g-1(黃河藥市)；在實(shí)驗(yàn)室所購(gòu)買的青木香中均未檢測(cè)到木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯。
　　 3.建立了香連丸中生物堿類成分的指紋圖譜測(cè)定方法，色譜條件同季胺型生物堿的含量測(cè)定。選用藥根堿、巴馬汀和小檗堿為參照物，通過(guò)對(duì)9批自制及6批市售香連丸的指紋圖譜的分析，共標(biāo)定了10個(gè)共有峰，建立了香連丸指紋圖譜的共有模式。相似度分析表明，在波長(zhǎng)350 nm下，15批香連丸的相似度

9、分別為99.80％,99.81％和99.81％(自制)，99.80％,99.82％和99.79％(自制)，99.76％,99.80％和99.81％(自制)，98.15％，98.12％和98.29％(佛慈藥廠)，98.22％，98.24％和98.27％(湖北某藥業(yè)公司)，平均相似度為99.17％。實(shí)驗(yàn)表明，自制與市售香連丸之間，以及自制和市售制劑本身之間具有很好的相關(guān)性。在相同的色譜條件下，對(duì)黃連藥材進(jìn)行指紋圖譜分析，并與香連丸的指紋圖譜

10、共有模式進(jìn)行相似度比較，結(jié)果表明，黃連藥材與香連丸有10個(gè)峰匹配，且10個(gè)匹配峰跟香連丸制劑的共有峰的保留時(shí)間和紫外吸收幾乎完全相同，黃連藥材樣品與制劑的相似度在99.51％～99.78％之間，其平均相似度為99.59％，RSD為0.076％。表明各個(gè)藥店購(gòu)買的黃連藥材之間沒(méi)有大的差別，黃連在炮制前后跟制劑的相似度無(wú)明顯區(qū)別，但炮制的黃連經(jīng)滲漉后，與制劑的相似度更接近于1，在一定程度上說(shuō)明制劑所用藥材與我們購(gòu)買到的黃連藥材品種、來(lái)源、質(zhì)

11、量及處理工藝相似。
　　 以上結(jié)果表明所建立的這5種組分的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，不僅可以用于香連丸及制劑藥材中這5種組分的含量測(cè)定，而且也為含有黃連和木香藥材的中藥制劑的質(zhì)量控制提供了方法參考。本實(shí)驗(yàn)采用相似度評(píng)價(jià)結(jié)合藥材與制劑指紋圖譜譜峰匹配及上述的活性組分含量測(cè)定等多指標(biāo)評(píng)價(jià)的方法，可以用于中藥制劑的質(zhì)量考察，且方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，具有一定的可操作性。
　　 二.木香醇提物中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯

12、的藥代動(dòng)力學(xué)及其組織分布研究
　　 1.建立了小鼠血漿中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的HPLC定量分析方法。色譜條件同上述木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明，兩種成分分離度佳，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。方法平均回收率在86.5～101.8％之間，日內(nèi)及日間精密度的RSD均小于5％，最低檢測(cè)限和最低定量限分別為21.27 ng·mL-1和785 ng·mL-1；71ng·mL-1和2.62μg·mL-1。并將該法用于小鼠體內(nèi)木香

13、提取物中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的藥代動(dòng)力學(xué)研究——昆明小鼠14組(每組6只，每一取血時(shí)間點(diǎn)為1組)，單次灌胃給予木香提取物后，于0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0、8.0、12.0、24.0和36.0 h摘眼球取血獲取血漿，以乙腈沉淀蛋白，取上清夜揮干，甲醇復(fù)溶定容后進(jìn)樣分析。灌胃木香醇提物30 min時(shí)，血漿中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰濃度分別為0.0133和0.0308 mg·mL-1

14、。用Drug And Statistics of Windows1.0(DAS1.0)藥代動(dòng)力學(xué)程序進(jìn)行模擬，結(jié)果顯示木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的血藥濃度-時(shí)間曲線均符合二室模型，血漿中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的t1/2a和t1/2β分別為0.690和9.908，0.292和11.094 h，相關(guān)系數(shù)為0.997和0.999，較去氫木香內(nèi)酯，木香烴內(nèi)酯吸收較快，而消除較慢。
　　 2.取血后的小鼠頸椎脫臼處死，分離胃、腸、肺、腎、

15、腦、肝和脾等組織(胃及腸用生理鹽水將內(nèi)容物沖洗干凈)，獲取不同時(shí)間點(diǎn)的各組織樣品，精密稱定各臟器組織，加2倍量生理鹽水制成勻漿液，再加4倍量的乙腈旋渦5 min，于4000r.min1離心10 min，取上清液，50℃下氮?dú)獯蹈?，?00μL甲醇溶解殘?jiān)?.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取上清液20μL。按上述建立的高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在組織中的最大峰濃度依次為C胃＞C肺＞C腸＞C腎＞C腦，分別為0.108和0

16、.159 mg·g-1；0.069和0.078 mg·g-1；0.010和0.048 mg·g-1；0.0059和0.0069mg·g-1；0.0027和0.0037 mg·g-1，其與血漿峰濃度之比為8.08和5.16；5.17和2.52；0.75和1.56；0.45和0.22；0.20和0.12；在肝臟和脾臟中并未測(cè)得上述兩種成分，可能原因?yàn)椋?.木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯均為小分子脂溶性化合物，其不經(jīng)過(guò)肝臟代謝，而直接經(jīng)胃粘膜或腸粘

17、膜被吸收；2.肝臟和脾臟對(duì)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的攝取率較低；3.由于脾臟的體積小，樣品的預(yù)處理可能會(huì)導(dǎo)致其由于其含量低于檢測(cè)限而未能檢測(cè)到。
　　 研究結(jié)果表明這兩種活性組分能較快的分布于各組織中，且在各組織中的最大濃度次序完全相同，依次是胃，肺，腸，腎，腦?？梢妰煞N組分在胃腸中的濃度均較高。這一結(jié)論與該藥的治療作用完全吻合。
　　 通過(guò)以上研究，為木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的作用機(jī)理的闡釋建立了理論基礎(chǔ)，也為其臨床應(yīng)