基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的芪藶強心膠囊中多組分分析與藥代動力學(xué)研究.pdf

1、芪藶強心膠囊是中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)研發(fā)的臨床廣泛用于慢性心力衰竭的中藥新藥，臨床使用已超過十年，為中國首個具有循證醫(yī)學(xué)研究證據(jù)、療效確切的治療慢性心衰的中成藥。芪藶強心膠囊由黃芪、附子、人參、丹參、葶藶子、澤瀉、紅花、玉竹、陳皮、桂枝、香加皮等十一味中草藥提取而成，其化學(xué)成分主要有皂苷類、黃酮類、酚酸類、生物堿等。目前關(guān)于芪藶強心膠囊研究多集中在臨床療效和藥理學(xué)研究方面，化學(xué)成分分析和質(zhì)量控制研究很少，也未有藥物代謝動力學(xué)研究的報道。本文采

2、用UPLC/Q-TOF-MS/MS作為主要分析方法，利用其快速高效、靈敏度高、特異性強的特點，對芪藶強心膠囊化學(xué)成分、血中移行成分進行定性鑒別，并對其9個主要藥效成分即烏頭生物堿進行定量分析與大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，為進一步闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)和參考價值。
　　第一部分 UPLC/Q-TOF-MS/MS法鑒定芪藶強心膠囊中化學(xué)成分
　　目的:建立一種超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-T

3、OF-MS/MS)全面快速地闡明芪藶強心膠囊的化學(xué)組成的分析方法。
　　方法:取芪藶強心膠囊樣品研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50％甲醇10 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，用50％甲醇補足至原重量后，搖勻，16000r/min離心10min，取上清夜，過濾(0.22μm)，取濾液進樣分析。色譜條件:色譜柱:Phenomenex Kinetex C18100×2.1mm，2.6μm。流動相為0.1％甲

4、酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序為:(0～0.5)min，10％ B;(0.5～2.5)min，10％→40％ B;(2.5～9)min,40％→70％B;(9～14)min,70％→90％B;(14～15)min,90％→100％B;(15～17)min,100％B;(17～17.1)min,100％→10％B;(17.1～19)min，10％B。柱溫:40℃;流速:400μL/min;進樣體積:5μL。質(zhì)譜色譜條件:離子化模

5、式為電噴霧正、負(fù)離子模式，正負(fù)離子源電壓分別為5500V/-4500V，離子源溫度為550℃，裂解電壓(DP)分別為60V/-55 V，碰撞能量(CE)分別為45 eV/-40 eV，碰撞能量擴展(CES)分別為15 eV/20eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為55 PSI，輔助氣2為55 PSI，氣簾氣為35 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為100-1500，IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為

6、50-1500，開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。數(shù)據(jù)采集軟件:Analyst(R) TF1.6 software(AB SCEIX，USA);數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng):Peakview1.2 software(AB SCEIX，USA)。獲取UPLC/Q-TOF MS/MS全掃描質(zhì)量色譜圖和源內(nèi)裂解的UPLC-TOF/MS色譜圖，參照對照品信息或通過分子離子精確質(zhì)量和同位素擬合度的分析確定分子式，在數(shù)據(jù)庫中檢索匹配的化合物，進而解析源內(nèi)裂解的質(zhì)譜圖

7、，從而對各色譜峰進行指認(rèn)。并在相同實驗條件下對芪藶強心膠囊及其組方各單味藥的色譜圖進行比對分析，歸屬色譜峰來源。
　　結(jié)果:從芪藶強心膠囊色譜圖中共鑒定了139個色譜峰，主要成分包括三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類、酚酸類、萜類等。本研究比較全面地闡明了芪藶強心膠囊的化學(xué)組成，為芪藶強心膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:該方法簡便、快速，靈敏度，可用于芪藶強心膠囊血中移行成分定性分析。
　　第二部分芪

8、藶強心膠囊UPLC血清指紋圖譜研究
　　目的:采用超高效液相色譜(UPLC)法建立芪藶強心膠囊血清指紋圖譜，為芪藶強心膠囊血清藥物化學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。
　　方法:大鼠灌胃給藥制備含藥血清，采用Waters ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流動相乙腈-0.1％甲酸水，梯度洗脫，流速0.5 mL·min-1，柱溫40℃，檢測波長280 nm，分析芪藶強心膠囊大鼠含藥

9、血清，并與相同條件下空白血清、體外全方及其11個單味藥圖譜比對，對色譜峰歸屬進行分析。
　　結(jié)果:建立了芪藶強心膠囊的UPLC血清指紋圖譜，共標(biāo)定了13個共有峰，指認(rèn)了其中4個共有峰，均為藥源性成分，來自香加皮。10批芪藶強心膠囊血清指紋圖譜的相似度均在0.868～1.000。
　　結(jié)論:本研究建立的方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，可用于芪藶強心膠囊血清藥物化學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。
　　第三部分 UPLC/Q-TOF-MS

10、/MS法鑒定芪藶強心膠囊血中移行成分
　　目的:建立一種超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MS/MS)全面快速地闡明芪藶強心膠囊血中移行成分的分析方法。
　　方法:采用UPLC/Q-TOF-MS/MS方法，對比芪藶強心膠囊、空白血清、芪藶強心膠囊含藥血清總離子流圖，質(zhì)譜圖等信息，通過對比各色譜峰的保留時間及質(zhì)譜圖裂解規(guī)律，確認(rèn)大鼠灌胃芪藶強心膠囊內(nèi)容物后血中移行成分及其歸屬。
　　

11、結(jié)果:大鼠口服芪藶強心膠囊后血中共發(fā)現(xiàn)61個入血成分，其中34個為芪藶強心膠囊中原形成分，27個為原形藥物的代謝產(chǎn)物。本研究將為闡明芪藶強心膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。
　　結(jié)論:該方法簡便、快速，靈敏度，可以用于芪藶強心膠囊化學(xué)成分定性分析。
　　第四部分 UPLC/Q-TOF-MS/MS法快速測定芪藶強心膠囊及其附子中的9個烏頭類生物堿成分含量
　　目的:建立一種簡便、準(zhǔn)確、可靠的UPLC/Q-TOF-MS/MS分析

12、方法，用于芪藶強心膠囊和附子中9個烏頭類生物堿成分的含量測定。
　　方法:取芪藶強心膠囊樣品研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50％甲醇10 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，用50％甲醇補足至原重量后，搖勻，16000r/min離心10min，取上清夜，過濾(0.22μm)，取濾液進樣分析。色譜條件:色譜柱:Phenomenex Kinetex C18100×2.1 mm，2.7μm。流動相由0.1％甲酸

13、水(A)和乙腈(B)組成，梯度洗脫:0～1 min(10％B),1～2 min(10-30％ B),2～6 min(30-40％ B),6～7min(40-100％B),7～8 min(100％ B),8～8.1 min(100-10％B),8.1～1.0 min(10％B).柱溫:40℃;流速:400μL/min;進樣體積:5μL。每次進樣預(yù)平衡5min，再進行梯度洗脫。質(zhì)譜色譜條件:離子噴霧電壓，5.5KV;離子源溫度，550℃;解

14、簇電壓(DP)，60 V和碰撞能量(CE)，35eV。氮氣為霧化氣和輔助氣，霧化氣50 psi，輔助氣50 psi，氣簾氣35 psi。在m/z100-1500amu質(zhì)量范圍ESI正離子模式下進行全掃描，積累時間250ms。IDA采用標(biāo)準(zhǔn):每個分析物，超過100 cps的八個最強的碎片離子在100～1500amu質(zhì)量范圍內(nèi)進行子離子掃描，累積時間70 ms。碰撞電壓差20 eV，動態(tài)背景扣DBS開啟。自動校準(zhǔn)系統(tǒng)(CDS)對MS和MS/

15、MS自動進行調(diào)諧和校正。數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用Analyst(R)TF1.6軟件、PeakView(R)1.2軟件和MultiQuantTM2.1.1軟件。
　　結(jié)果:在一定濃度區(qū)間內(nèi)9種分析物的線性關(guān)系良好，r2＞0.9940;所有分析物定量限LOQ范圍0.03～0.50ng/mL，日內(nèi)精密度、日間精密度RSD均小于3.38％，重復(fù)性試驗RSD均小于4.23％。加樣回收率在95.35～106.21％范圍內(nèi)，4℃放置24h穩(wěn)定性良

16、好。芪藶強心復(fù)方配伍改變了復(fù)方中附子的上述9個生物堿的構(gòu)成比和總生物堿含量，毒性最大的DDAs(AC、MA、HA)含量明顯減少，而MDAs相對含量顯著增高。
　　結(jié)論:該方法簡便快速，靈敏度高，選擇性好，可用于芪藶強心膠囊和附子中9個烏頭類生物堿成分的含量測定，并為芪藶強心膠囊的質(zhì)量控制提供了新的分析方法和手段。
　　第五部分基于UPLC/Q-TOF-MS/MS的芪藶強心膠囊中9個烏頭類生
　　物堿大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)

17、研究
　　目的:建立一種UPLC/Q-TOF-MS/MS的芪藶強心膠囊中9個烏頭類生物堿大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究分析方法，建立其藥-時曲線，獲得藥動學(xué)參數(shù)與特征，為臨床用藥提供參考。
　　方法:大鼠禁食不禁水12h，灌胃給予芪藶強心膠囊內(nèi)容物，分別于給藥前和給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h乙醚麻醉腹主動脈取血，至經(jīng)肝素處理的離心管中，3000 r/min離心10 min，分離血漿，采用

18、固相萃取法預(yù)處理樣品，內(nèi)標(biāo)為地西泮。PhenomenexKinetex C18100×2.1mm，2.7μm;流動相為0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序為0～1 min，5％B;1～3 min，5％→10％B;3～13 min，10％→60％B;13～13.5 min,60％→5％B;13.5～15 min,5％B。柱溫:40℃，流速:400μL/min。質(zhì)譜條件離子化模式:電噴霧離子源(ESI)，正離子模式;TOF-M

19、S質(zhì)譜掃描范圍為50-1500 Da; MS/MS質(zhì)譜掃描范圍為50-1500 Da，噴霧電壓(IS)為5500 V;霧化溫度為550℃，霧化氣(Gas1，N2)為50 psi，輔助氣(Gas2，N2)為50 psi，氣簾氣(Cur, N2)為35 psi，裂解電壓(DP)60V，碰撞能量(CE)44V，碰撞能量擴展(CES)15V。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用APCI Positive校正液（利血平）校正。數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用Analyst(R)

20、TF1.6軟件、PeakView(R)1.2軟件和MultiQuantTM2.1.1軟件。藥動學(xué)數(shù)據(jù)采用非室模型處理，用excel軟件分析數(shù)據(jù)。達峰時間(Tmax)和峰濃度(Cmax)由血藥濃度曲線直接獲得。消除常數(shù)(k)由曲線最后4個點的斜率的對數(shù)計算得到。消除半衰期T1/2=0.693/k。
　　結(jié)果:血漿中附子靈、尼奧林、塔拉地薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿在0.25～7

21、5ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2≥0.9946），最低定量限(LLOQ)≤0.247ng/mL。日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)0.4％～5.0％，相對誤差(RE)為-2.4％～6.7％。平均提取回收率為85.70％～97.37％,基質(zhì)效應(yīng)分別介于94.63～99.32％。大鼠灌胃芪藶強心膠囊內(nèi)容物后附子靈、尼奧林、塔拉地薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿在體內(nèi)吸收迅速，迅速