基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的槐角苷藥動(dòng)學(xué)研究及槐角丸與連翹葉多組分分析.pdf

1、中藥槐角為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥成熟果實(shí)?，F(xiàn)代臨床藥理研究表明，槐角具有止血、抗癌、抗腫瘤、抗肥胖、抗生育、抗氧化的作用，通常用于治療高血壓和痔瘡?；苯擒帐腔苯侵泻孔罡叩囊环N黃酮成分，并且能夠水解成染料木素。中藥單體的研究，特別是對(duì)中藥單體代謝的研究，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的關(guān)注。中藥和天然產(chǎn)物的藥動(dòng)學(xué)研究對(duì)于了解其活性成分的作用機(jī)理有著重要的意義。研究藥物的排泄有助于判斷藥物的療效、毒副作用，為藥物的

2、給藥方式和給藥劑量提供了一個(gè)可靠的科學(xué)依據(jù)。然而，到目前為止，關(guān)于槐角苷及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)研究和排泄研究的報(bào)道很少，槐角苷轉(zhuǎn)化為染料木素的速率直接影響著槐角苷的活性。因此，本文采用了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC)研究槐角苷及其代謝物的藥動(dòng)和排泄。
　　槐角丸，由槐角（炒）、地榆（炭）、黃芩、枳殼（炒）、當(dāng)歸、防風(fēng)組成?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明，槐角丸具有止血涼血、抗癌、抗肥胖、抗高血壓的作用，被廣泛用于治療痔瘡、高血壓和牙痛。為

3、了進(jìn)一步有效地使用中藥復(fù)方和提高臨床安全，需要對(duì)槐角丸的多組分進(jìn)行分析測(cè)定，建立一個(gè)準(zhǔn)確、可靠地質(zhì)量控制方法。本研究首次建立了一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單快速同時(shí)測(cè)定槐角丸中15種有效成分含量的分析方法。
　　連翹為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物連翹(Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl)的干燥果實(shí)。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，連翹葉具有抑制嘔吐、保肝、抑制彈性蛋白酶、利尿作用、止痛、抗氧化、抗內(nèi)毒素及

4、抗病毒的作用。連翹多為野生，資源有限，連翹葉Forsythia Folium是連翹植物的干燥葉，具有與連翹基本相同的化學(xué)成分。為了確定連翹葉合適的采收期，本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)14個(gè)不同采收期連翹葉中的9種主要成分進(jìn)行測(cè)定，期望對(duì)連翹葉資源的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。
　　第一部分槐角苷及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)研究
　　目的:建立了一種HPLC-MS方法同時(shí)測(cè)定大鼠灌胃給予單體槐角苷后，大鼠血漿中槐角

5、苷及其代謝物染料木素的含量，并研究其藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。
　　方法:色譜條件:色譜柱:DiamonsilTMC18(150 mm×4.6 mm，5μm，Dikma);流動(dòng)相:甲醇(A)-水(B)（含有0.02％的甲酸）。梯度洗脫;流速:0.8 mL/min。質(zhì)譜條件:多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè);內(nèi)標(biāo)為磺胺甲噁唑(SMZ)。大鼠灌胃給予槐角苷20 mg/kg，分別于5，15，30，45，60，90，120，180，270

6、，360 min（第一組）和1.5，3，4.5，5.5，6，7，8，9，10，11，12，18，24，36，48，72 h（第二組）眼內(nèi)眥取血。樣品用乙酸乙酯液液萃取。
　　結(jié)果:該方法的精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、定量限、穩(wěn)定性、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)均符合要求，槐角苷及其代謝物染料木素在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，灌胃給予槐角苷單體后在大鼠血漿中檢測(cè)到了染料木素，驗(yàn)證說(shuō)明了染料木素是槐角苷的代謝產(chǎn)物?；苯擒盏难帩舛?/p>

7、達(dá)峰時(shí)間為48.75±7.50 min，在360 min時(shí)血藥濃度降到LLOQ，半衰期(t1/2)為59.78±7.19 min。染料木素的t1/2為103.14±16.97 min，消除速率比槐角苷慢。染料木素的AUC0-∞（954.28±168.60μg min/mL）比槐角苷的AUC0-∞（40.29±3.13μg min/mL）高出大約24倍，這說(shuō)明槐角苷在體內(nèi)能吸收后能很快的代謝為染料木素。染料木素的藥物濃度-時(shí)間曲線在435

8、 min和600 min處出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，最主要的原因推測(cè)可能與肝腸循環(huán)有關(guān)，有待進(jìn)一步確認(rèn)。
　　結(jié)論:本研究首次采用HPLC-ESI-MS法同時(shí)定性和定量分析了大鼠血漿中槐角苷及其代謝物染料木素，并成功應(yīng)用于大鼠灌胃給予槐角苷后的藥代動(dòng)力學(xué)研究。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專屬性好，為槐角苷的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。
　　第二部分 HPLC-MS法測(cè)定大鼠膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物的含量
　　目的:建立一種HPL

9、C-MS法測(cè)定大鼠膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物染料木素的方法。
　　方法:色譜條件:色譜柱:DiamonsilTMC18（150mm×4.6mm，5μm，Dikma);流動(dòng)相:甲醇(A)-水(B）（含有0.02％的甲酸）。梯度洗脫;流速:0.8 mL/min。質(zhì)譜條件:多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè);內(nèi)標(biāo)為磺胺甲噁唑(SMZ)。按照20 mg/kg的劑量給SD大鼠灌胃槐角苷的羧甲基纖維素鈉混懸液，膽汁按照0-2，

10、2-4，4-6，6-8，8-12，12-24，24-30和30-36h收集，尿液按照0-2，2-4，4-8，8-12，12-24，24-36，36-48和48-72h收集，糞便按照0-4，4-8，8-10，10-12，12-24，24-36，36-48 h時(shí)間段收集。分別測(cè)定膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物的濃度。
　　結(jié)果:槐角苷原形藥物經(jīng)膽汁30 h內(nèi)排泄完全，排泄量主要集中在0～24 h，約占總排泄量的91.75％，經(jīng)膽汁

11、排泄的排泄總量約為總給藥量的0.0111％，說(shuō)明槐角苷原形藥物經(jīng)膽汁排泄量較少，可能與肝的首過(guò)效應(yīng)有關(guān)?；苯擒赵嗡幬锝?jīng)尿液排泄量主要集中在0～36 h，約占總排泄量的98.05％，經(jīng)尿液排泄的排泄總量約為總給藥量的1.76％;槐角苷在糞便中需要48h能排泄完全，排泄量主要集中在0～24 h，約占總排泄量的95.61％，總給藥量的11.13％。染料木素的總排泄量在膽汁中為0.42±0.02μg，尿液10.15±0.22μg，糞便2.92

12、±0.13μg，由此可見(jiàn)，染料木素主要通過(guò)尿液和糞便排泄，這可能與槐角苷在肝和胃腸道的代謝有關(guān)，需要進(jìn)一步研究確證。
　　結(jié)論:本研究采用快速、專屬和靈敏度高的HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁、尿液和糞便中槐角苷及其代謝物染料木素的濃度，并成功應(yīng)用于大鼠灌胃給予槐角苷后的排泄研究，為槐角苷的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。
　　第三部分 HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定槐角丸中15種成分的含量
　　目的:建立一種快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)測(cè)定槐角

13、丸中15種化學(xué)成分（槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素、山柰酚、黃芩素、黃芩苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、漢黃芩素、升麻素和升麻素苷）的HPLC-MS分析方法，并用于不同于廠家的槐角丸的分析。
　　方法:采用DiamonsilTMC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm，Dikma)，柱溫30℃，以甲醇-0.03％甲酸水(v/v)溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL;采用電噴霧離

14、子源進(jìn)行正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，離子源溫度為650℃，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)用于定量分析?；苯擒铡⑷玖夏拒?、染料木素、蘆丁、槲皮素、山柰酚、黃芩素、黃芩苷、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、新橙皮苷、漢黃芩素、升麻素和升麻素苷的檢測(cè)離子對(duì)分別為431.2/268.0,431.2/268.2,268.7/133.0,609.3/301.0,301.0/150.9,284.6/92.9,269.3/65.1,445.4/268.7,579.3/150.9

15、,271.2/150.9,609.4/301.2,609.5/301.1,285.2/270.1,307.1/259.2和469.4/307.2。
　　結(jié)果:槐角苷中15種成分在30 min內(nèi)可完全分離;峰面積與濃度線性關(guān)系良好;加樣回收率為97.25％-102.8％，精密度RSD為0.14％-2.55％。聚類分析對(duì)40批槐角丸樣品分類區(qū)分，來(lái)自同一個(gè)廠家的樣品被分為同一類，而不同廠家生產(chǎn)的藥品存在著明顯的差異。
　　結(jié)論:

16、首次建立HPLC-MS法同時(shí)定性和定量分析槐角丸中15種成分的含量。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于槐角丸的質(zhì)量控制。
　　第四部分 HPLC-MS法測(cè)定不同采收期連翹葉中9種成分的含量
　　目的:建立HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定連翹葉中連翹苷、連翹脂素、連翹酯苷A、連翹酯苷F、蘆丁、槲皮素、異槲皮苷、綠原酸、(+)-表松脂素-4'-O-葡萄糖苷的量。
　　方法:采用Dikma Diamonsil C18色譜柱

17、(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫30℃，以甲醇-0.02％甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，體積流量0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL;采用電噴霧離子源，進(jìn)行負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)用于定量分析，源噴射電壓為-4500V，離子源溫度為650℃。
　　結(jié)果:9種化學(xué)成分的峰面積和濃度在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，加樣回收率為97.20％～101.2％，精密度RSD為0.54％～1.24％。