基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的連翹體內(nèi)外代謝研究.pdf

1、中國(guó)藥典(2010年版一部)收載的連翹為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物連翹(Forsythia suspense(Thunb.)Vahl)的干燥果實(shí)。該屬植物多叢生于山野荒坡間，各地亦有人工栽培。廣泛分布在遼寧、河北、等地。人們對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該植物富含木脂素類、黃酮類、苯乙醇類及揮發(fā)油類等成分。連翹為中醫(yī)常用的清熱解毒藥，近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)連翹藥理學(xué)作用的報(bào)道也逐漸增多，主要集中在以下幾方面：抗菌作

2、用、抗病毒、抗炎作用、抗內(nèi)毒素作用、抑制彈性蛋白酶、cAMP磷酸二酯酶活力的作用、保肝、利尿作用、解熱作用及鎮(zhèn)吐、鎮(zhèn)痛作用等。迄今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該植物的化學(xué)成分分離與鑒定、體外定量分析研究較為廣泛，而對(duì)于體內(nèi)外代謝研究涉及頗少。然而連翹在中藥處方中占有很大的比重，研究連翹的體內(nèi)外代謝途徑，探索連翹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)就顯得格外重要。
　　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)具有專屬性高、快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)，是目前化學(xué)成分定性和定量分析的有力

3、工具。本研究采用LC-MS技術(shù)建立連翹中5種有效成分在大鼠膽汁中的定量分析方法，為闡明其體內(nèi)代謝途徑奠定基礎(chǔ)；LC和LC-MS法研究大鼠腸內(nèi)菌體外轉(zhuǎn)化連翹苷的代謝產(chǎn)物，并用制備液相制備出3種代謝產(chǎn)物，核磁共振技術(shù)確定代謝物結(jié)構(gòu)；建立血漿樣品中連翹苷及其2種代謝產(chǎn)物的LC-MS定量分析方法，探索其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；建立灌胃給予大鼠連翹苷水溶液后，不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠膽汁、糞便和尿液中連翹苷及其3種代謝物的定量分析方法，研究其體內(nèi)排泄規(guī)律，進(jìn)一步

4、了解連翹苷的體內(nèi)代謝過程及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　第一部分 LC-ESI-MS-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁中連翹5種有效成分的含量
　　目的：建立一種專屬性好、靈敏快捷的方法同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁中連翹5種有效成分的含量，考察其在大鼠體內(nèi)的膽汁排泄動(dòng)力學(xué)規(guī)律。
　　方法：大鼠按20 mg/kg灌胃給予連翹水提液后于不同時(shí)間點(diǎn)采集膽汁樣品，用LC-ESI-MS技術(shù)MRM負(fù)離子掃描模式定量分析膽汁中連翹5種有效成分的經(jīng)時(shí)變化。質(zhì)譜條件：

5、離子源為電噴霧離子化源(ESI)；采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè)；源噴射電壓(IS)為-4500 V；霧化溫度為600℃；霧化氣(GS1，N2)：40 psi；輔助氣(GS2，N2)：50 psi；氣簾氣(N2)：25 psi。5種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為(+)-pinoresinol-β-D-glucoside(519.3/357.2)，matairesinol-4’-O-glucoside(519.3/357.2)，h

6、yperin(463.2/300.1)，phillyrin(533.5/371.2)，phillygenin(371.2/356.1)。色譜條件：色譜柱：Sapphire C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó))，Sapphire C18保護(hù)柱；流動(dòng)相：含0.1％甲酸的甲醇-水，梯度洗脫；流速：0.7 mL/min；分析時(shí)間：15 min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。
　　結(jié)果：所建立的方法精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)

7、限和定量限均符合要求，被測(cè)5種有效成分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。膽汁排泄藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明，連翹5種有效成分在36 h內(nèi)經(jīng)膽汁排泄完全，5種有效成分的排泄量都主要集中在10～12 h。5種有效成分的膽汁累積排泄量分別約占給藥量的0.002％，0.234％，0.116％，0.288％和12.700％。
　　結(jié)論：本研究建立了LC-ESI-MS-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁中連翹5種有效成分的含量，可用于連翹中5種有效成分在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)

8、研究，該方法簡(jiǎn)便、快速。專屬性好，可用于連翹5種有效成分在大鼠膽汁中的定量分析，該法對(duì)連翹藥材的體內(nèi)定量分析具有重要意義。
　　第二部分大鼠腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化連翹苷的代謝產(chǎn)物研究
　　目的：將連翹苷與大鼠腸內(nèi)菌于體外厭氧溫孵培養(yǎng)，建立LC-MS/MS方法研究腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化連翹苷的代謝產(chǎn)物。并放大制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)率最高的代謝物。
　　方法：將大鼠新鮮糞便和連翹苷于體外厭氧溫孵培養(yǎng)，對(duì)連翹苷進(jìn)行體外代謝研究，尋找代謝產(chǎn)物并進(jìn)行放大制備，得到

9、代謝產(chǎn)物單體，通過1H-NMR和MS方法鑒定其代謝產(chǎn)物，確定結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)3種代謝產(chǎn)物，用制備液相放大制備，純化得到3種代謝產(chǎn)物的單體，通過1H-NMR和MS法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)鑒定，代謝產(chǎn)物分別2-[(3'，4'-二羥基)苯基]-6-[(3''，4''-二羥基)苯基]駢雙四氫呋喃(M1)、2-[(3'，4'-二羥基)苯基]-6-[(3''，4''-二甲氧基)苯基]駢雙四氫呋喃(M2)、2-[(3'，4'-二羥基)苯基]

10、-3-羥甲基-4-[(3''，4''-二甲氧基)苯甲基]四氫呋喃(M3)。
　　結(jié)論：腸內(nèi)菌法可用來研究連翹苷的體外代謝，為進(jìn)一步研究連翹的代謝途徑奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分 HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中連翹苷及其2種代謝物的含量
　　目的：建立一種可用于測(cè)定大鼠血漿中連翹苷、2-[(3’，4’-二羥基)苯基]-6-[(3''，4''-二羥基)苯基]駢雙四氫呋喃(M1)和2-[(3'，4'-二羥基)苯基]-6-[(

11、3''，4''-二甲氧基)苯基]駢雙四氫呋喃(M2)含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予連翹苷水溶液后的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　方法：收集灌胃給予大鼠連翹苷水溶液后的血漿樣品，用丙酮沉淀蛋白后進(jìn)行樣品分析，以甲醇-水(各含0.1％的甲酸)作為流動(dòng)相梯度洗脫，磺胺甲噁唑(SMZ)作為內(nèi)標(biāo)，正負(fù)離子模式下同時(shí)監(jiān)測(cè)。連翹苷(552.10/249.20)在正離子模式下檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)SMZ(254.10/156.00)；M1(328.90

12、/136.90)、M2(357.00/151.00)在負(fù)離子模式下檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)SMZ(252.00/155.90)。
　　結(jié)果：該方法精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限和定量限均符合要求，血漿中連翹昔、M1和M2在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性范圍。M1和M2藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)具有一致性，連翹苷原藥消除較快，達(dá)峰早于M1和M2。
　　結(jié)論：該方法專屬性好、簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，可用于大鼠灌胃連翹苷后，血漿中連翹苷和其2種代謝物的藥代動(dòng)力學(xué)研究，

13、該結(jié)果可為連翹的臨床用藥提供參考依據(jù)。
　　第四部分連翹苷及其3種代謝物在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)
　　目的：建立一個(gè)快速簡(jiǎn)便的方法定量灌胃給藥后大鼠膽汁、糞便和尿液中連翹苷及其三種代謝物，考察連翹苷及其3種代謝物M1、M2和M3在大鼠膽汁、糞便和尿液中排泄動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步完善連翹苷的體內(nèi)代謝。
　　方法：大鼠按20 mg/kg灌胃給予連翹苷水溶液后于不同時(shí)間采集膽汁、糞便、尿液樣品，用LC-ESI-MS技術(shù)MRM正負(fù)離子同

14、時(shí)監(jiān)測(cè)的方法分析膽汁、糞便和尿液中連翹苷及其3種代謝物的經(jīng)時(shí)變化。以甲醇-水(各含0.1％的甲酸)作為流動(dòng)相梯度洗脫，磺胺甲噁唑(SMZ)作為內(nèi)標(biāo)，連翹苷(552.10/249.20)在正離子模式下檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)SMZ(254.10/156.00)；M1(328.90/136.90)、M2(357.00/151.00)、M3(359.00/146.80)在負(fù)離子模式下檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)SMZ(252.00/155.90)。
　　結(jié)果：膽汁、糞