基于液質聯(lián)用技術的中藥三種單體成分體外代謝研究.pdf

1、藥物在體內經吸收、分布之后，可經藥物代謝酶催化生成代謝產物，產生藥理或毒理作用，研究藥物代謝對明確其代謝途徑和代謝機制具有重要的指導意義。肝臟是參與藥物代謝的重要器官，富含藥物代謝酶，是藥物發(fā)生I相和II相代謝反應的主要場所。肝微粒體是肝內代謝酶的主要來源，包含催化I相代謝的CYP450酶和II相代謝的UGTs等酶類。其代謝模型操作簡單、價格合理、儲存方便，現(xiàn)被廣泛應用于體外藥物代謝的研究中。
　　近年來，隨著中藥現(xiàn)代化研究及藥物

2、分析技術的發(fā)展，對中藥單體成分特別是對中藥有效成分的代謝研究逐漸成為人們關注的熱點。本研究選取中藥白芷主要成分香豆素類化合物蛇床夫內酯及中藥芫花主要成分黃酮類化合物羥基芫花素和芫花素，利用高分辨質譜及液質聯(lián)用技術，采用人肝微粒體溫孵、重組酶溫孵及化學抑制劑試驗等方法，對三個單體成分在人肝微粒體中的代謝進行研究并對代謝表型進行鑒別，推測可能的代謝途徑并進行比較，為進一步理解其代謝機制提供依據(jù)和技術支持。
　　第一部分：蛇床夫內酯、羥

3、基芫花素和芫花素在人肝微粒體中的代謝產物鑒定
　　目的：本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，建立蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫花素的人肝微粒體體外溫孵模型，對其在人肝微粒體中的代謝產物進行結構推斷和鑒定，并歸納總結其代謝途徑，為進一步闡明其體內過程提供理論依據(jù)。
　　方法：通過向含有人肝微粒體的溫孵體系中加入NADPH和UDPGA作為反應啟動因子，建立I相代謝、葡萄糖醛酸化代謝及級聯(lián)代謝反應的溫孵模型。建立UHPL

4、C-Q-TOF-MS/MS方法對蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體溫孵樣品中的各類代謝產物進行檢測，將采集到的高分辨質譜數(shù)據(jù)借助Peakview1.2和MetabolitePilot1.5數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，總結三個化合物的質譜裂解規(guī)律，推測代謝產物結構并推斷其代謝途徑。
　　結果：采用蛇床夫內酯對照品對溫孵樣品內的原型藥物進行確證，正離子模式下，蛇床夫內酯主要脫去異戊烯基形成m/z233的特征碎片離子，而后連續(xù)丟失CO

5、，符合香豆素類化合物的一般裂解規(guī)律。通過與空白組和對照組溫孵樣品比較，在溫孵樣品中共鑒定出24個蛇床夫內酯的I相代謝產物，分別為蛇床夫內酯經氧化、與水加成、羧基化和脫氫作用生成。其中加氧后的羥基化代謝物 M1、M2和環(huán)氧化代謝物 M3為蛇床夫內酯在人肝微粒體中最主要的代謝產物。但是未檢測到蛇床夫內酯及其I相代謝物的葡萄糖醛酸化代謝產物，可能與其結構中不含易與葡萄糖醛酸發(fā)生II相結合反應的活潑H有關。
　　采用羥基芫花素和芫花素對照

6、品對溫孵樣品內的原型藥物進行確證，負離子模式下，羥基芫花素和芫花素主要發(fā)生黃酮類化合物特征性的RDA裂解。通過與空白組和對照組溫孵樣品比較，在羥基芫花素溫孵樣品中共發(fā)現(xiàn)10個代謝產物，其中包括3個I相代謝產物、3個葡萄糖醛化產物和4個級聯(lián)反應產物。在芫花素溫孵樣品中共發(fā)現(xiàn)19個代謝產物，其中包括7個I相代謝物、2個葡萄糖醛酸化代謝物和10個級聯(lián)反應代謝物。兩化合物經去甲基和氧化引入羥基，而后與葡萄糖醛酸結合，II相代謝為其主要代謝反應類

7、型。
　　結論：三種單體成分均發(fā)生I相代謝反應，引入羥基等極性基團，代謝產物極性增大，黃酮類成分羥基芫花素和芫花素更能與葡萄糖醛酸結合發(fā)生 II相代謝反應，葡萄糖醛酸化代謝產物極性進一步增加，更易于排出體外。
　　第二部分：蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫花素在人源CYP450酶中的代謝表型鑒定
　　目的：本試驗應用HPLC-Q-TRAP-MS/MS和UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，分別采用肝微粒體結合選擇性化學抑制

8、劑和cDNA重組酶孵育法，對參與蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中代謝的CYP450酶表型進行鑒定，為闡明其代謝機制和臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：將蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫花素與CYP450酶各亞型的選擇性化學抑制劑在人肝微粒體中共同孵育，對三個單體成分反應后的剩余量進行測定，然后與不加入化學抑制劑的陰性對照溶液比較，考察化學抑制劑對三個單體成分代謝轉化率的影響。
　　建立蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫

9、花素與CYP450各亞型重組酶的溫孵體系，測定CYP450重組酶溫孵樣品中三個單體成分反應后的剩余量，與加入滅活肝微粒體的對照組相比，應用底物消除法評價CYP450酶對藥物清除的貢獻。
　　結果：蛇床夫內酯化學抑制劑試驗結果顯示，其代謝轉化率隨著CYP1A2和 CYP3A4的選擇性抑制劑α-萘黃酮和酮康唑濃度的增加有較為顯著的下降。與CYP450重組酶的溫孵反應中，隨著反應時間的增加，重組酶CYP1A2和CYP3A4溫孵體系中蛇床

10、夫內酯的消較為明顯，而其他亞型組含量變化較小。CYP1A2和CYP3A4能夠催化蛇床夫內酯生成其主要單氧化代謝產物M1、M2和M3。
　　羥基芫花素和芫花素的代謝轉化率均隨 CYP1A2、CYP2C9和CYP2C19的選擇性抑制劑α-萘黃酮、磺胺苯吡唑和鹽酸噻氯匹定濃度的增加有明顯下降，以CYP2C9最為顯著。與CYP450重組酶的溫孵反應中，隨著反應時間的增加，重組酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4可催化

11、羥基芫花素和芫花素代謝消除。CYP1A2和CYP3A4可同時催化去甲基和單氧化反應， CYP1A2的催化活性高于CYP3A4。CYP2C9和CYP2C19主要介導羥基芫花素的去甲基化代謝，以CYP2C9的催化活性最高。
　　結論：蛇床夫內酯、羥基芫花素和芫花素均可經CYP1A2和CYP3A4催化生成主要的氧化代謝產物，CYP2C9和CYP2C19在催化羥基芫花素和芫花素去甲基化反應中發(fā)揮重要作用，代謝表型的鑒定也為進一步研究藥物在

12、生物體內的生物轉化及預測藥物相互作用提供了理論依據(jù)。
　　第三部分：羥基芫花素和芫花素在人源UGT酶中的代謝表型鑒定
　　目的：應用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，采用人肝微粒體 UGT重組酶孵育法，對參與羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中代謝的UGT酶表型進行鑒定，為闡明其代謝機制和臨床安全合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：建立羥基芫花素和芫花素與 UGT重組酶的溫孵體系，通過UHPLC-Q-TOF-MS/M

13、S方法測定溫孵樣品中葡萄糖醛酸化代謝物的生成量，并比較葡萄糖醛酸化代謝產物在各UGT亞型酶中的生成情況。
　　結果：試驗結果表明，UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7可參與羥基芫花素和芫花素在人肝微粒體中的葡萄糖醛酸化代謝；UGT1A1和UGT1A9可介導兩個黃酮類化合物A環(huán)5-羥基和B環(huán)3'-和4'-羥基葡萄糖醛酸化，且催化活性較高；而 UGT1A3、UGT1A10和UGT2B7只介導B環(huán)羥基參

14、與反應，且以UGT1A10催化活性最高。
　　結論：羥基芫花素和芫花素的葡萄糖醛酸化代謝可經 UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9、UGT1A10和UGT2B7介導，推測UGT1A1、UGT1A9和 UGT1A10為參與羥基芫花素和芫花素葡萄糖醛酸化代謝的主要 UGT酶。
　　第四部分：蛇床夫內酯對人肝CYP450酶的抑制作用
　　目的：采用探針底物法，根據(jù)FDA指導原則選擇細胞色素P450酶亞型特異性探針底物，研

15、究蛇床夫內酯對人肝 CYP1A、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4這7種CYP450酶亞型的影響。
　　方法：應用體外肝微粒體溫孵體系，建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法，測定各亞型特異性探針底物生成代謝產物的含量，采用 GraphPad Prism6.0軟件進行非線性擬合并計算 IC50值，從而評價蛇床夫內酯對CYP450酶7個亞型的體外潛在抑制作用。
　　結果：蛇床夫內酯與CYP450酶各亞型探針底

16、物共同孵育結果顯示，蛇床夫內酯可對CYP3A4產生中等強度抑制作用，IC50=6.61μmol·L-1；對CYP2C9和 CYP2C19產生弱抑制作用，IC50值分別為20.09和17.49μmol·L-1；對于CYP1A、2B6、2C8和2D6基本不存在抑制作用，IC50均大于100μmol·L-1。
　　結論：蛇床夫內酯可對CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4產生抑制作用，與經這3個CYP450亞型酶代謝的藥物合用時可能

17、因其對酶的抑制作用造成藥物蓄積，使血藥濃度升高，因此需要在聯(lián)合用藥時多加注意。
　　第五部分：蛇床夫內酯在人肝微粒體中的酶促反應動力學研究
　　目的：研究蛇床夫內酯在人肝微粒體中的酶促反應動力學，優(yōu)化溫孵試驗反應條件，并計算其酶促反應動力學參數(shù)。
　　方法：考察溫孵時間、蛋白濃度和底物濃度對溫孵體系的影響。以磺胺甲噁唑為內標，Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），甲醇和1 mmol·L

18、-1乙酸銨水溶液為流動相，進行梯度洗脫，電噴霧離子源（ESI源），正離子模式下 MRM監(jiān)測，測定人肝微粒體溫孵樣品中蛇床夫內酯的含量。采用 Linewrave-Burk作圖法處理數(shù)據(jù)，計算酶促動力學參數(shù)Km和Vmax。
　　結果：蛇床夫內酯在人肝微粒體體系中最佳溫孵時間為60 min，蛋白濃度為1 mg·mL-1，底物濃度為30μmol·L-1。Km=48.75μmol·L-1， Vmax=0.5068μmol·(min·mg p