基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的中藥單體成分體外代謝研究.pdf

1、防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng) Saposshnikovia divaricata(Turcz) Schischk.未抽花莖的干燥根，味辛甘，性溫，具有解表祛風(fēng)、滲濕、止痙的功效，臨床常用于治療感冒頭痛，風(fēng)濕痹痛，風(fēng)疹瘙癢，破傷風(fēng)等癥。研究表明，升麻素苷和升麻素為防風(fēng)的主要活性成分，有較強(qiáng)的抗炎消腫和解熱鎮(zhèn)痛作用。
　　染料木苷(genistin)，為廣泛存在于大豆、槐、染料木中的異黃酮類(lèi)化合物，它具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和

2、抗真菌活性，對(duì)白血病、骨質(zhì)疏松、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多種疾病有積極的治療和預(yù)防作用。
　　本研究應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UHPLC-Q-TOF-MS)，采用大鼠與人肝微粒體溫孵試驗(yàn)，對(duì)升麻素苷和升麻素在肝微粒體中的主要Ⅰ相、Ⅱ相代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究與比較，探討在肝藥酶作用下的生物轉(zhuǎn)化途徑。并采用UGT重組酶溫孵法，對(duì)參與升麻素葡萄糖醛酸化結(jié)合的UGT酶亞型進(jìn)行鑒別。應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)，測(cè)定升麻素在大鼠肝微

3、粒體中酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)并研究升麻素在體外對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A酶的抑制作用，為進(jìn)一步研究藥物相互作用提供相關(guān)參考。對(duì)染料木苷在大鼠肝微粒體中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，優(yōu)化反應(yīng)條件，并計(jì)算其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　第一部分升麻素苷在人和大鼠肝微粒體中的代謝研究
　　目的:通過(guò)對(duì)人和大鼠肝微粒體溫孵樣品中升麻素苷代謝產(chǎn)物的分析，總結(jié)藥物代謝規(guī)律，為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法:Ⅰ相代謝孵育試驗(yàn):向孵育體系

4、中加入NADPH還原系統(tǒng)，將升麻素苷分別與人和大鼠肝微粒體進(jìn)行體外溫孵，應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，檢測(cè)推斷Ⅰ相代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　?、蛳啻x孵育試驗(yàn):向孵育體系中加入U(xiǎn)DPGA、丙甲菌素、MgCl2等輔酶，將升麻素苷分別與人和大鼠肝微粒體進(jìn)行體外溫孵，應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)，推斷Ⅱ相代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:在人和大鼠肝微粒體樣品中均檢測(cè)到5種升麻素苷的Ⅰ相代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物種類(lèi)沒(méi)有差別。在人和

5、大鼠肝微粒體樣品中均未檢測(cè)到升麻苷Ⅱ相葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)論:升麻素苷在人和大鼠肝微粒體中均發(fā)生生物轉(zhuǎn)化而形成代謝產(chǎn)物，在不同種屬肝微粒體中代謝產(chǎn)物種類(lèi)相同，代謝途徑主要為羥基化和水解反應(yīng)。
　　第二部分升麻素在人和大鼠肝微粒體中的代謝研究
　　目的:通過(guò)對(duì)人和大鼠肝微粒體溫孵樣品中升麻素代謝產(chǎn)物的分析比較，推測(cè)藥物代謝規(guī)律，并對(duì)參與升麻素葡萄糖醛酸化的UGT酶亞型進(jìn)行鑒別。
　　方法:Ⅰ相代謝孵育試驗(yàn):

6、向孵育體系中加入NADPH還原系統(tǒng)，將升麻素分別與人和大鼠肝微粒體進(jìn)行體外溫孵，應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，檢測(cè)推斷Ⅰ相代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　?、蛳啻x孵育試驗(yàn):向孵育體系中加入U(xiǎn)DPGA、丙甲菌素、MgCl2等輔酶，將升麻素分別與人和大鼠肝微粒體進(jìn)行體外溫孵，應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，檢測(cè)推斷Ⅱ相代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　　UGT重組酶試驗(yàn):將升麻素與人UGT重組酶進(jìn)行體外溫孵，檢測(cè)葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，鑒別參與

7、代謝的酶亞型。
　　結(jié)果:在人肝微粒體溫孵樣品中共檢測(cè)到9種Ⅰ相代謝產(chǎn)物，2種Ⅱ相代謝產(chǎn)物。在大鼠肝微粒體溫孵樣品中共檢測(cè)到11種Ⅰ相代謝產(chǎn)物，2種Ⅱ相代謝產(chǎn)物。
　　UGT重組酶試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在UGT1A1，UGT1A9，UGT2B4，UGT2B7四種亞型溫孵的樣品中，檢測(cè)到2種Ⅱ相葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)論:升麻素在人和大鼠肝微粒體中均發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化而生成代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物種類(lèi)有差異，推測(cè)可能是由于參與代謝的亞型

8、在不同種屬間種類(lèi)和含量不同。重組酶試驗(yàn)結(jié)果表明，UGT1A1，UGT1A9，UGT2B4，UGT2B7四種亞型都參與了催化產(chǎn)生葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。
　　第三部分升麻素在大鼠肝微粒體中的酶促動(dòng)力學(xué)以及對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A酶的抑制作用
　　目的:建立HPLC-MS法，研究升麻素在大鼠肝微粒體中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，計(jì)算其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并研究升麻素對(duì)大鼠藥物代謝酶CYP3A活性的影響。
　　方法:酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn):以磺

9、胺甲噁唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，DiamonsilTM C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），甲醇-0.1％甲酸水，梯度洗脫，電噴霧離子源（ESI源），正離子模式下MRM監(jiān)測(cè)，采用底物消除法，對(duì)升麻素進(jìn)行定量測(cè)定。應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km。
　　對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A酶的抑制作用:將大鼠肝微粒體體外溫孵體系、探針底物、系列濃度升麻素共同孵育5 min，反應(yīng)終止后，檢測(cè)

10、代謝產(chǎn)物生成量以代表酶的活性，采用GraphPad Prism5.0計(jì)算升麻素對(duì)CYP3A酶的IC50值。
　　結(jié)果:升麻素在大鼠肝微粒體中最佳溫孵時(shí)間為30 min，蛋白濃度為1 mg·mL-1，底物濃度為25μmol·L-1。升麻素Km=32.60±2.52μmol·L-1，Vmax=0.2731±0.0074μmol·(min·mg protein)-1。
　　升麻素對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A的IC50值為131.7μm

11、ol·L-1
　　結(jié)論:該方法簡(jiǎn)單、可靠，適用于升麻素的體外代謝研究，升麻素對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A無(wú)抑制作用。
　　第四部分染料木苷在大鼠肝微粒體中的代謝及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:建立HPLC-MS法，鑒定染料木苷在大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物，并研究其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
　　方法:建立大鼠肝微粒體體外孵育體系對(duì)染料木苷進(jìn)行代謝研究，應(yīng)用HPLC-MS法鑒定其體外代謝產(chǎn)物。以磺胺甲噁唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用代謝物生成法，

12、對(duì)代謝產(chǎn)物染料木素進(jìn)行定量測(cè)定。應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km。
　　結(jié)果:染料木苷在體外孵育體系中生成代謝產(chǎn)物，經(jīng)鑒定其為苷元染料木素。染料木苷在大鼠肝微粒體中最佳溫孵時(shí)間為40 min，最佳蛋白濃度為1 mg·mL-1，底物濃度為25μmol·L-1，代謝產(chǎn)物染料木素酶促反應(yīng)的Vmax=0.1042±0.0033μmol·(min·mg pro)-1,Km=28.96±