基于液質(zhì)聯(lián)用法的蛋白絕對(duì)定量技術(shù)開(kāi)發(fā)及其在單抗類(lèi)藥物臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的建立使得針對(duì)特定抗原，具有良好特異性和高度均一性的單克隆抗體的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，而在基因工程研究中涌現(xiàn)的技術(shù)突破則為抗體人源化和全序列人抗體的研究奠定了基礎(chǔ)，使得醫(yī)用單克隆抗體成為當(dāng)今藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。相較于小分子藥物，單克隆抗體能特異而高效地識(shí)別并結(jié)合靶點(diǎn)，具有藥效強(qiáng)，副作用小和藥物半衰期長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤、自身免疫性疾病、慢性炎癥反應(yīng)、器官移植排斥及病毒感染等的治療中獲得廣泛應(yīng)用。而在藥物研發(fā)過(guò)程中，可靠，精準(zhǔn)且靈

2、敏的分析定量方法必不可少。現(xiàn)有定量方法的金標(biāo)準(zhǔn)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法雖然具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)限低且通量高的長(zhǎng)處，但也存在結(jié)果重現(xiàn)性差，線性范圍窄，復(fù)雜基質(zhì)的內(nèi)源性干擾等弊端。在小分子定量領(lǐng)域應(yīng)用成熟的液質(zhì)聯(lián)用法被引入到抗體等蛋白的定量操作中，并展現(xiàn)出光明的前景。
　　能夠高通量，高靈敏度地測(cè)定多肽序列，鑒定蛋白的質(zhì)譜已是蛋白組學(xué)研究中不可或缺的鑒定手段，樣品處理方法的革新和加速數(shù)據(jù)處理的生物信息學(xué)軟件的涌現(xiàn)，使得液質(zhì)聯(lián)用法在定量蛋白組

3、學(xué)中同樣應(yīng)用日增。但受制于現(xiàn)有蛋白分離方法和質(zhì)譜檢測(cè)范圍，除少數(shù)個(gè)例，將單一目標(biāo)蛋白從復(fù)雜基質(zhì)中充分分離，并直接定量仍極具挑戰(zhàn)性；因此，將生物樣品蛋白酶解，通過(guò)測(cè)定酶解產(chǎn)物中指紋肽濃度來(lái)間接定量目標(biāo)蛋白水平的自下而上策略，即鳥(niǎo)槍法，發(fā)展迅速。在絕對(duì)定量蛋白組學(xué)中，在生物基質(zhì)中能夠唯一指向目標(biāo)蛋白的指紋肽，含有酶解位點(diǎn)的指紋肽衍生物和標(biāo)準(zhǔn)蛋白都曾用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，而對(duì)應(yīng)的同位素標(biāo)記物也用作內(nèi)標(biāo)以校正定量結(jié)果的偏差。但這些不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)生

4、物基質(zhì)中同一目標(biāo)蛋白定量結(jié)果的準(zhǔn)確度的影響，以及對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)定量結(jié)果的偏差的校正效果，尚無(wú)系統(tǒng)性的比對(duì)研究；同時(shí)，鳥(niǎo)槍法用于定量蛋白組學(xué)的基礎(chǔ)，即指紋肽的篩選和確證還沒(méi)有被廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)和流程。
　　針對(duì)定量蛋白組學(xué)中自下而上的鳥(niǎo)槍法的上述不足，在本論文的工作中了建立完整的目標(biāo)蛋白指紋肽篩選，肽段鑒定搭建納升色譜與線性離子阱/軌道阱雜交質(zhì)譜系統(tǒng)作為肽段鑒定平臺(tái)。目標(biāo)蛋白經(jīng)牛胰蛋白酶水解后，經(jīng)納升色譜分離通過(guò)納升噴霧即Nano

5、ESI進(jìn)入雜交質(zhì)譜系統(tǒng)，獲得線性離子阱質(zhì)譜和高分辨的靜止軌道阱質(zhì)譜聯(lián)動(dòng)分析，通過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)列出質(zhì)譜檢測(cè)到的所有肽段，并確定其在特定生物基質(zhì)中的候選指紋肽列表；使用低流速色譜與三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)建立蛋白定量平臺(tái)評(píng)估候選指紋肽，通過(guò)在線正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化候選指紋肽的SRM參數(shù)并評(píng)估其穩(wěn)定性，比較不同候選指紋肽的靈敏度，以得到最佳指紋肽及其最優(yōu)SRM參數(shù)用于定量。此二平臺(tái)被成功用于anti-HCV單抗的指紋肽篩選和最佳指紋肽SRM參數(shù)的優(yōu)化，并