基于衍生化與LC-MSn聯(lián)用研究生物樣品中難測定藥物的定量測定及其在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、體內(nèi)藥物分析是藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)。藥代動(dòng)力學(xué)研究中，由于藥物受給藥劑量、生物利用度、代謝轉(zhuǎn)化等多種因素的影響，通常在生物樣品中濃度低，雜質(zhì)干擾大，因此需要高靈敏度和高專屬性的分析方法研究藥代動(dòng)力學(xué)。LC-MSn技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，可以多組分同時(shí)檢測，已成為藥代動(dòng)力學(xué)研究中廣泛使用的主要研究手段。隨著LC-MSn的廣泛應(yīng)用，其應(yīng)用的一些局限性也逐漸顯現(xiàn)出來。如一些藥物難電離而導(dǎo)致靈敏度差；一些有機(jī)小分子藥物由于保留差，生物樣品分析時(shí)

2、，易受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾而產(chǎn)生很強(qiáng)的基質(zhì)抑制等。
　　 本文首先應(yīng)用化學(xué)衍生化，改變LC-MS"難測定藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)而改變其物理和化學(xué)特性，再應(yīng)用LC-MS“實(shí)現(xiàn)生物樣品中難測定藥物的定量測定。通過化學(xué)衍生化的方法，可以改善藥物在LC-MS"檢測中的色譜與質(zhì)譜行為，從而達(dá)到提高檢測靈敏度、降低生物基質(zhì)內(nèi)其他雜質(zhì)的干擾和降低基質(zhì)抑制的目的。另外，本文還將親水作用色譜技術(shù)應(yīng)用于生物樣品中藥物的定量分析，并將衍生化或/和親水作用色譜技術(shù)

3、與LC-MS“相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了一些生物樣品中難測定藥物的定量分析。
　　 本文將難測定藥物按照官能團(tuán)進(jìn)行分類，包括酚羥基、醇羥基、酮和醛、羧基和胺基，每種官能團(tuán)選擇幾個(gè)代表藥物，研究衍生化反應(yīng)。首先尋找有助于提高LC-MS“檢測性能的衍生化試劑，同時(shí)要求衍生化試劑具有衍生化反應(yīng)效率高、操作簡單快速，定量生成穩(wěn)定衍生物的特點(diǎn)。根據(jù)初步研究分別確定酚羥基的衍生化試劑為月’磺酰氯(Dansyl chloride，DNS-C1)；酮和醛的

4、衍生化試劑為對(duì)甲基磺酰肼(Toluene sulfonyl hydrazine，TSH)；羧基采用甲醇和乙醇為衍生化試劑；醇羥基衍生化試劑為甘油三甲基銨（Glycidyltrimethylammonium，GTMA）；胺基衍塵化試劑為氯甲酸-9-芴基甲酯(9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-C1)。
　　 在確定衍生化試劑的前提下，對(duì)可能的影響因素進(jìn)行考察，主要包括反應(yīng)溫度、時(shí)間、催化劑的種

5、類和濃度、溶劑的種類和衍生化試劑的濃度等。并比較衍生化前后的色質(zhì)譜行為的改變，評(píng)價(jià)衍生化反應(yīng)對(duì)LC-MS"檢測生物樣品中含各官能團(tuán)的代表藥物的作用。
　　 ①通過對(duì)DNS-CI和含酚羥基代表藥物KL-1、丹皮酚、咖啡酸（雙羥基）和大黃酚（雙羥基）的衍生化反應(yīng)考察，確定衍生化反應(yīng)較為通用的條件為：反應(yīng)系統(tǒng)為乙腈系統(tǒng)；衍生溫度為60℃;衍生時(shí)間為10-15 min;；緩沖鹽pH為10-10.5;水相和有機(jī)相的比例約為1：3-1：5，

6、依據(jù)藥物的不同而不同。衍生化后，各藥物衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+比原藥物增加233;由于酚羥基不易電離，通過衍生化引入易電離的叔胺基團(tuán)，可顯著提高含酚羥基藥物的離子化效率從而提高檢測靈敏度。同時(shí)由于衍生化物非極性增大，色譜保留時(shí)間延長和色譜峰形改善。
　　 ②通過對(duì)TSH和含酮基的孕二烯酮、米非司酮和丹皮酚的衍生化反應(yīng)考察，確定衍生化反應(yīng)較為通用的條件為：反應(yīng)溫度在40℃-60℃之間，反應(yīng)時(shí)間為≤8h，催化劑三氟乙

7、酸濃度在0.5-5％之間時(shí)。衍生化后，各藥物衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+比原藥物增加168;由于反應(yīng)生成更加易于質(zhì)譜電離的腙，所以色譜行為主要表現(xiàn)為靈敏度提高。
　　 ③通過甲醇或乙醇和含羧基代表藥物L(fēng)20051117、FS-3和SH-1（雙羧基）的衍生化反應(yīng)考察，確定衍生化反應(yīng)較為通用的條件為：反應(yīng)體系鹽酸/甲醇和鹽酸/乙醇比例均為1：9；反應(yīng)的衍生溫度為60-70℃;衍生時(shí)間為20-40 min。甲基化質(zhì)譜準(zhǔn)分子

8、離子峰[M+1]+比原藥物增加14，乙基化增加28。羧酸一般在ESI模式下檢測靈敏度不高，在復(fù)雜生物基質(zhì)中由于基質(zhì)效應(yīng)和高背景噪音，有時(shí)直接測定不能滿足體內(nèi)生物樣品的檢測靈敏度要求。當(dāng)在藥物的羧基上引入甲基或乙基后，可以通過增加藥物檢測的m/z和增加藥物的保留時(shí)間，降低基質(zhì)抑制和高背景噪音來提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。
　　 ④通過對(duì)GTMA和醇羥基代表藥物伏格列波糖、半乳糖、D-木糖和葡萄糖的衍生化反應(yīng)考察，確定衍生化反應(yīng)較為通用的

9、條件為：反應(yīng)溫度約為55℃，反應(yīng)時(shí)間≥4h，衍生化試劑的濃度為50%，催化劑濃度為1N。衍生化后，各藥物衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+比原藥物增加116。同樣，通過衍生化引入易電離的叔胺基團(tuán)，可以顯著提高單糖類藥物的檢測靈敏度，顯著改善峰形和顯著提高信噪比，使液質(zhì)測定單糖類藥物成為可能。
　　 ⑤通過對(duì)FMOC-CI和加巴噴丁的衍生化反應(yīng)考察，確定衍生化反應(yīng)較為通用的條件為：衍生化溫度為40℃;衍生化時(shí)問為20-40

10、min;緩沖鹽的pH=10。衍生化后，各藥物衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[M+l]+比原藥物增加222;通過對(duì)小分子胺類藥物的結(jié)構(gòu)修飾，其衍生物非極性顯著增大，保留時(shí)間顯著延長，但是檢測靈敏度未見提高。
　　 在上述研究基礎(chǔ)上，分別建立了KL-1（酚羥基）、月．皮酚（酮基）、L20051117（羧基）、伏格列波糖（醇羥基）和加巴噴?。ò坊┑雀鞴倌軋F(tuán)代表藥物在生物樣品中的衍生化LC-MS聯(lián)用定量測定方法，在完成方法系統(tǒng)驗(yàn)證的基礎(chǔ)

11、上，對(duì)實(shí)際的生物樣品進(jìn)行檢測。研究結(jié)果表明，各個(gè)衍生化反應(yīng)定量測定方法經(jīng)過系統(tǒng)驗(yàn)證，均可滿足實(shí)際生物樣品中藥物的PK/PD研究。對(duì)于未經(jīng)衍生化難于測定的藥物，通過衍生化，或顯著提高了檢測靈敏度，或顯著增加了保留時(shí)間，或降低基質(zhì)抑制和雜質(zhì)干擾，而且衍生化后，峰形都有所改善，信噪比提高。
　　 另外，本文還應(yīng)用新型的測定方法：HILIC-MS"實(shí)現(xiàn)對(duì)反相色譜難保留的胺基類藥物的非衍生化方法的測定。以鹽酸美金胺、加巴噴丁和鹽酸特拉唑嗪

12、為代表藥物應(yīng)用HILIC進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，相比反相色譜，HILIC有以下三個(gè)優(yōu)勢：①在流動(dòng)相中可以使用較高的有機(jī)相，有利于質(zhì)譜檢測靈敏度提高；②對(duì)極性化合物有很好的保留；③較低的基質(zhì)抑制效應(yīng)和雜質(zhì)干擾。相比衍生化方法，可以避免前處理耗時(shí)長的問題。
　　 總之，衍生化LC-MSn聯(lián)用的方法對(duì)于測定一些LC-MS“難測定的藥物是十分有效的方法，該方法可以從根本上解決一些藥物穩(wěn)定性差、色譜保留差、雜質(zhì)干擾大和檢測靈敏度不高等問題