鹽酸雷諾嗪含量測(cè)定與手性拆分以及藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、雷諾嗪(Ranolazine)是由美國(guó)CV Therapeutics公司最新研發(fā)的部分脂肪酸氧化酶(pFOX)抑制劑，臨床上用于治療穩(wěn)定型心絞痛及治療充血性心力衰竭。雷諾嗪通常與鹽酸成鹽后使用，它有一個(gè)手性中心，但目前以消旋體形式上市。本研究采用高效液相色譜法對(duì)鹽酸雷諾嗪(Ranolazinehydrochloride)進(jìn)行了含量測(cè)定并用手性色譜柱對(duì)其進(jìn)行了拆分。為了闡明鹽酸雷諾嗪在大鼠體內(nèi)的吸收規(guī)律，為臨床合理用藥提供依據(jù)，我們以大鼠

2、為研究對(duì)象，采用高效液相色譜技術(shù)，研究單次給藥后不同劑量鹽酸雷諾嗪在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)過程。 第一部分鹽酸雷諾嗪的含量測(cè)定與手性拆分目的：研究鹽酸雷諾嗪原料藥的含量測(cè)定與手性拆分，為對(duì)其進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究奠定色譜基礎(chǔ)。 方法：(1)高效液相色譜法測(cè)定鹽酸雷諾嗪消旋體的含量；取鹽酸雷諾嗪供試品適量，用甲醇溶解，調(diào)整流動(dòng)相比例，確定檢測(cè)波長(zhǎng)，記錄色譜圖，并進(jìn)行方法學(xué)考察。(2)高效液相色譜手性固定相拆分外消旋鹽酸雷諾嗪：選

3、擇不同的色譜柱，不同的流動(dòng)相組成以及不同的流動(dòng)相pH值，最終確定拆分的色譜條件。(3)鹽酸雷諾嗪光學(xué)異構(gòu)體的含量測(cè)定：按拆分的色譜條件分別對(duì)消旋鹽酸雷諾嗪的兩光學(xué)異構(gòu)體定量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。 結(jié)果：(1)測(cè)定條件如下：色譜柱：RESTEKRC18；流動(dòng)相：甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH4.5)(55:45)；檢測(cè)波長(zhǎng)：272nm；流速：1mL·min-1；柱溫：35℃。重復(fù)性良好，RSD為0.9％。測(cè)得鹽酸雷諾嗪原料藥的

4、含量為99.0％。(2)在下述條件下：色譜柱：CHIRALCELROD-R，(5μm×4.6mm×250mm)；流動(dòng)相：甲醇-水(高氯酸-高氯酸鈉緩沖溶液，pH5.15)(90:10)；檢測(cè)波長(zhǎng)：272nm；流速：0.4mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL鹽酸雷諾嗪的兩光學(xué)異構(gòu)體可以達(dá)到完全分離，峰形對(duì)稱。(3)色譜條件同(2)，該方法重復(fù)性良好，RSD分別為0.4％和0.6％，經(jīng)測(cè)定兩光學(xué)異構(gòu)體的含量分別為99.0％和99

5、.5％。 結(jié)論：本文建立了鹽酸雷諾嗪含量測(cè)定和手性固定相拆分外消旋鹽酸雷諾嗪的方法，為其質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)，可有效控制鹽酸雷諾嗪的質(zhì)量。 第二部分鹽酸雷諾嗪在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究目的：建立大鼠血漿中鹽酸雷諾嗪濃度的RP-HPLC測(cè)定方法，比較單次給藥后不同劑量藥物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，研究其在大鼠體內(nèi)的吸收特點(diǎn)。 方法：(1)生物樣本中藥物濃度的測(cè)定方法：采用RP-HPLC測(cè)定生物樣本中鹽酸雷諾嗪的濃

6、度。(2)色譜條件的確定：選擇固定相，并對(duì)流動(dòng)相的組成、配比、流速等因素進(jìn)行分析，確定最佳色譜條件。(3)生物樣本的預(yù)處理：取大鼠血漿，置具塞離心管中，加2倍量乙腈沉淀蛋白，渦流混旋振蕩1min，離心10min(10000r·min-1)，吸取上清液，注入液相色譜儀，記錄鹽酸雷諾嗪的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。(4)方法的專屬性試驗(yàn)：取鹽酸雷諾嗪對(duì)照品溶液、大鼠空白血漿、加入鹽酸雷諾嗪對(duì)照品的空白血漿，按照已確定的色譜條件注入色譜儀，

7、記錄色譜圖。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性范圍：取系列濃度的鹽酸雷諾嗪對(duì)照品溶液，加入離心管中，氮?dú)獯蹈?，加入大鼠空白血漿100μL，渦流混旋，離心，取上清液，制得一系列空白血漿對(duì)照溶液，經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，離心取上清液注入液相色譜儀，記錄鹽酸雷諾嗪的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(6)定量下限(LLOQ)：以標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點(diǎn)的濃度定為定量下限，要求能夠測(cè)定3～5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的濃度，或Cmax1/10～1/20的濃度。(7)提取回收率試驗(yàn)：取

8、大鼠空白血漿，加入低、中、高3種不同濃度鹽酸雷諾嗪對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度5份，記錄鹽酸雷諾嗪的峰面積，另取等量的相同3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋至同體積，同法測(cè)定，以二者峰面積的比值為提取回收率。(8)精密度試驗(yàn)：取大鼠空白血漿，加入不同濃度的鹽酸雷諾嗪對(duì)照品溶液制成低、中、高3種濃度的生物樣品溶液，每個(gè)濃度5份，在一天內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算方法的日內(nèi)精密度；另配制上述3種不同濃度的溶液5份，連續(xù)三天進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品的日間精密度。(

9、9)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取空白血漿100μL，加入不同濃度的鹽酸雷諾嗪對(duì)照品溶液制成低、高兩個(gè)濃度(0.60，15.00μg·mL-1)各3個(gè)樣本，考察其室溫放置4h，樣品預(yù)處理后室溫放置4h、24h及經(jīng)3次冷凍.解凍循環(huán)后鹽酸雷諾嗪的穩(wěn)定性。(10)鹽酸雷諾嗪在大鼠體內(nèi)吸收實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：取禁食12h自由飲水的SD大鼠18只，隨機(jī)分為高、中和低劑量三組，每組6只，按50mg·kg-1。、25mg·kg-1、12.5mg·kg-1灌胃給予鹽酸雷諾嗪原

10、料藥溶液，分別于0、5、10、20、30、40、50、90、180、360、540、720min經(jīng)眼底靜脈叢取血，每次取血3002，4000r·min-1離心10min，分別取血漿100zE，加200μL乙腈沉淀蛋白，渦流混旋1min，離心10min(10000r·min-1)，吸取上清液，注入液相色譜儀，記錄各樣品的峰面積，計(jì)算血漿藥物濃度。(11)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析：采用梯形法對(duì)血藥濃度和時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，將三種劑量鹽酸雷諾嗪灌胃

11、后所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，比較三者的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有無顯著性差異。結(jié)果：(1)生物樣品測(cè)定：最佳色譜條件為RESTEKCRC18色譜柱(5μmx250mmx4.6mm)；二級(jí)管陣列檢測(cè)器；甲醇一醋酸鹽緩沖液(55:45)；檢測(cè)波長(zhǎng)：272nm:流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量為20μL。(2)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：在上述色譜條件下，鹽酸雷諾嗪分離良好，血漿中雜質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾測(cè)定，且靈敏度高，樣品中

12、鹽酸雷諾嗪的理論塔板數(shù)均大于4000，保留時(shí)間為12.7min左右，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以生物樣品中藥物濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)線性回歸得知，鹽酸雷諾嗪的血藥濃度在0.125～20.00μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2.132X+0.0893，r=0.9985(n=8)。(4)血漿中鹽酸雷諾嗪的定量下限濃度為0.015μg·mL-1(5)

13、血漿中鹽酸雷諾嗪低、中、高3種不同濃度的平均提取回收率分別為89.7％±7.1％，99.0％±6.5％和101.5％±3.6％，RSD分別為7.9％，6.6％和3.6％。(6)血漿中的鹽酸雷諾嗪低、中、高3種濃度樣品的日內(nèi)精密度分別為16.3％，12.0％和5.6％，日間精密度分別為17.3％，14.8％和5.1％。(7)樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，含鹽酸雷諾嗪的血漿樣品室溫放置4h，預(yù)處理后室溫放置4h、24h和經(jīng)三次冷凍-解凍循環(huán)后穩(wěn)定

14、，相對(duì)誤差均在±15％之間，RSD％＜15％。(8)大鼠口服三劑量鹽酸雷諾嗪后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：12.5mg·kg-1鹽酸雷諾嗪時(shí)，Cmax=(5.2±2.0)μg·mL-1,Tmax1=(22.5±5.0)min，Tmax2=(50.0±0.0)min，T1/2=(2.6±0.3)h，Ke=(0.00454±0.0041)min-1，AUC0～t=(20.1±6.4)μg·h mL-1，AUCt～∞=(20.8±6.5)μg·h m

15、L-1，25mg·kg-1鹽酸雷諾嗪時(shí)，Cmax=(6.4±1.6)μg·h mL-1，Tmax1=(22.5±5.0)min，Tmax2=(50.0±0.0)min，T1/2=(4.2±1.6)h，Ke=(0.0022±0.0044)min-1，AUC0～t,=(28.9±6.4)μg·h mL-1，AUCt～∞=(37.3±11.7)μg·h mL-1，50mg·kg-1鹽酸雷諾嗪時(shí)，Cmax=(13.3±2.5)μg·mL-1，T

16、max1=(22.5±5.0)min，Tmax2=(50.0±0.0)min，T1/2=(4.5±1.1)h，Ke=(0.0026±0.0105)min-1，AUC0～t=(62.8±11.2)μg·h·mL-1，AUCt～∞=(73.1±11.1)μg·h mL-1。(9)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：采用梯形法和SAS軟件對(duì)血藥濃度和時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)計(jì)算三個(gè)劑量的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax，T1/2無顯著性差異(P＞0.05)。AUC0-t和Cm