骨痹舒片中制馬錢子含量測(cè)定方法及藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的:骨痹舒片是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中成藥。主要含有制馬錢子、制何首烏、桑寄生、黃芪等中藥成分。制馬錢子是骨痹舒片中君藥之一，制馬錢子中馬錢子堿和士的寧既是有效成分又是毒性成分，為了保證骨痹舒片質(zhì)量可控，臨床用藥安全、有效，建立骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧的含量測(cè)定方法；進(jìn)一步建立兩種成分在生物樣品中的測(cè)定分析方法，研究馬錢子堿和士的寧在復(fù)方制劑中的藥動(dòng)學(xué)過程，了解處方因素對(duì)制馬錢子粉的影響，實(shí)驗(yàn)以制馬錢子粉、熱痹清片作為對(duì)照，為臨床合理

2、用藥以及馬錢子堿和士的寧在體內(nèi)的代謝研究提供一定的參考依據(jù)。
　　方法:1.骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧含量測(cè)定方法的建立。以馬錢子堿和士的寧的含量作為指標(biāo)，考察提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間等供試品制備條件；進(jìn)一步對(duì)HPLC方法學(xué)進(jìn)行考察，建立測(cè)定骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧的含量測(cè)定方法。
　　2.生物樣品中馬錢子堿和士的寧含量測(cè)定方法的建立。生物樣品的制備采用液液萃取法以及高速離心方式進(jìn)行分離純化。以峰面積為指標(biāo)，對(duì)三氯甲烷

3、、甲基叔丁醚、正己烷-二氯甲烷-異丙醇三種提取溶劑進(jìn)行考察，并進(jìn)一步考察萃取溶劑用量、萃取次數(shù)等條件。質(zhì)譜-色譜條件的建立，以鹽酸克倫特羅為內(nèi)標(biāo)，以峰面積值和離子強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立質(zhì)譜分析方法；通過對(duì)流動(dòng)相 pH值、流動(dòng)相各組分的比例等參數(shù)的優(yōu)化和方法學(xué)考察，建立色譜分析方法。
　　3.研究骨痹舒片及馬錢子粉在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。采用大鼠灌胃給藥及斷尾取血的方式，通過 UPLC-MS-MS法測(cè)定馬錢子堿和士的寧含量，建立藥

4、代動(dòng)力學(xué)模型，探討含相同劑量馬錢子堿和士的寧的骨痹舒片、熱痹清片和制馬錢子粉在大鼠體內(nèi)的吸收代謝規(guī)律及其差異。
　　結(jié)果:1.建立 HPLC法測(cè)定骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧含量測(cè)定的方法。樣品制備采用堿性三氯甲烷為溶劑，超聲提取60min。色譜柱為 Agilent C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇25％∶緩沖液（水∶乙酸∶三乙胺=230∶2.4∶0.3）75%，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱

5、溫25℃，進(jìn)樣量10μL。馬錢子堿在0.0948～1.1376μg（r2=1）、士的寧在0.1208～1.4496μg（r2=0.9999）范圍內(nèi)線性良好。平均回收率馬錢子堿為97.37%，RSD為1.26%；士的寧為99.01%，RSD為0.91%。
　　2.建立超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS-MS）測(cè)定生物樣品中馬錢子堿和士的寧含量測(cè)定。生物樣品的制備采用甲基叔丁基醚液液萃取法以及高速離心方式進(jìn)行分離純化

6、。以鹽酸克倫特羅為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)譜條件：離子化方式：電噴霧（ESI），離子極性：positive(+)，工作參數(shù)：Capillary(KV)3.50，Extractor(V)4.00，Source Temperature(℃)110，DesolvationTemperature(℃)300，Cone Voltage Gas Flow(L/Hr)50，Desolvation Gas Flow(L/Hr)300，Gas Cell Pirani P

7、ressure(mbar)3.26e-3；色譜條件：色譜柱為Agela Technologies Venusil ASB C18柱，流動(dòng)相為乙腈：0.15%甲酸溶液（40：60），柱溫35℃，流速0.1mL/min，進(jìn)樣量5μL。在生物樣品中馬錢子堿的線性范圍0.074～19ng/mL（r2=0.991171）、士的寧的線性范圍0.198～50.75ng/mL（r2=0.996467）。馬錢子堿和士的寧的平均回收率分別為87.25%和8

8、7.76%，RSD分別為7.29%和8.54%；平均基質(zhì)效應(yīng)為93.48%和95.51%，RSD分別為5.87%和6.24%。
　　3.大鼠口服灌胃給予相同含量的馬錢子堿和士的寧的骨痹舒片、熱痹清片與制馬錢子粉，經(jīng)測(cè)定分析三種樣品中馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程均為二房室模型。骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧的達(dá)峰時(shí)間分別為27.5min和37.5min，達(dá)峰濃度分別為5.467ng/mL和22.483ng/mL，CL/F分

9、別為4205.938L/min/kg和654.955L/min/kg，AUC(0-∞)分別為973.58ng/L·min和4526.795ng/L·min，Ka分別為0.068min-1和0.046min-1，t1/2ka分別為14.726min和9.285min，t1/2β為285.299min和385.394min，t1/2α為25.849min和45.958min；制馬錢子粉中馬錢子堿和士的寧的達(dá)峰時(shí)間分別為40min和42.5m

10、in，達(dá)峰濃度分別為4.667ng/mL和15.9ng/mL；CL/F分別為86.991L/min/kg和49.042L/min/kg，AUC(0-∞)分別為759.734ng/L·min和2135.14ng/L·min，Ka分別為0.235min-1和0.063min-1，t1/2ka分別為5.681min和9.285min，t1/2β為306.33min和385.394min，t1/2α為74.974min和45.958min。

11、r>　　結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定馬錢子堿和士的寧高效液相色譜的定量分析方法，該方法簡(jiǎn)單、快捷、提取完全，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧含量測(cè)定的方法。
　　2.本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究骨痹舒片在體內(nèi)的吸收、代謝過程，建立UPLC-MS-MS測(cè)定生物樣品中馬錢子堿和士的寧的含量測(cè)定。本方法靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析時(shí)間短，適用于大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧的濃度測(cè)定。生物樣品前處理采用甲基叔丁基醚液液萃取，以鹽酸克倫特羅為