生物樣品中藥物濃度的HPLC-MS-MS測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　 建立專(zhuān)屬、靈敏的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測(cè)定人血漿中比伐盧定和人尿液中二甲雙胍和羅格列酮的藥物濃度，并研究其在人體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。
　　 方法:
　　 (1)測(cè)定人血漿中比伐盧定的濃度:①樣品處理方法:向0.20mL血漿中分別加入50μL甲醇，50μL內(nèi)標(biāo)溶液(2.166μg/mL那法瑞林溶液)，渦旋30s混勻;加600μL甲醇，渦旋30s混勻;離心10min(13000

2、rpm)，取上清液40℃氮?dú)庀麓蹈?，殘?jiān)尤?00μL乙腈:水(20∶80，v/v)，渦旋30s混勻，取5μL進(jìn)樣分析。②質(zhì)譜分析:比伐盧定和內(nèi)標(biāo)那法瑞林在正離子檢測(cè)方式下，采用電噴霧電離源（ESI源），主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，分別為m/z1091.0和m/z662.2。選擇性對(duì)準(zhǔn)分子離子[M+H]+進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析，獲得比伐盧定的主要碎片為m/z650.3，響應(yīng)較強(qiáng)，比較穩(wěn)定且背景噪音低，因而被選作多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)定

3、量的產(chǎn)物離子，用于定量分析。那法瑞林生成的主要碎片離子為m/z328.7，將m/z328.7作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。③色譜條件為:本試驗(yàn)選定的色譜條件為:色譜柱:ZorbaxEclipseC18柱(50mm×2.1mmI.D，3.5μm，美國(guó)安捷倫公司);流動(dòng)相:乙腈∶0.2％甲酸=20∶80(v/v);流速:0.35mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5μL。④受試者的選擇:“申請(qǐng)藥物臨床試驗(yàn)報(bào)告、試驗(yàn)方案、健康志愿者知情同意書(shū)

4、”經(jīng)藥品臨床研究基地醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇健康志愿受試者30名，男女各半，年齡20～27歲，體重42～70kg，簽署知情同意書(shū)，于試驗(yàn)前在醫(yī)院接受全面的體格檢查，對(duì)肝、腎功能進(jìn)行化驗(yàn)測(cè)定，并進(jìn)行心電圖檢查，正常者方可入選。受試者無(wú)既往病史，平時(shí)很少服藥，不嗜煙酒，試驗(yàn)前14天內(nèi)未用任何藥物。臨床試驗(yàn)在醫(yī)院進(jìn)行，采血期間禁煙酒、咖啡因類(lèi)飲料，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。⑤給藥方案及樣品采集:30名受試者按性別和登記順序號(hào)分層隨機(jī)分成低、中、高三組，每

5、組各10人（男女各半），晚上統(tǒng)一進(jìn)清淡飲食，于試驗(yàn)前一天晚8:00開(kāi)始禁食，次日早上統(tǒng)一清淡飲食后，低、中、高劑量組受試者分別靜脈推注0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg比伐盧定注射液，服藥后2h內(nèi)不得飲水，不得臥下，服藥后2h可飲水，4h后統(tǒng)一進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐（低脂肪飲食）。分別于注射前(0h)和注射后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5h肘靜脈采血4mL，采集的血樣置于肝素化的試管

6、中，3000rpm離心10min，分離血漿置-70℃儲(chǔ)藏，用于血藥濃度檢測(cè)。⑥血漿樣品分析:未知血漿樣品的測(cè)定按“血漿樣品的分析方法”項(xiàng)下操作，每天建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)分析低、中、高（雙樣本）的質(zhì)控樣品，并以同批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣品中比伐盧定濃度和質(zhì)控樣品的濃度，由QC樣品的結(jié)果決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍，QC樣品的相對(duì)偏差應(yīng)在±15％范圍之內(nèi)。⑦數(shù)據(jù)處理:將各受試者不同時(shí)間樣品的血藥濃度數(shù)據(jù)及平均值與標(biāo)準(zhǔn)差列表并作圖;然后分別對(duì)每個(gè)受

7、試者的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)求算，并求出參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。Tmax、Cmax采用實(shí)測(cè)值;AUC0-t用梯形法計(jì)算;AUC0-∞=AUC0-t+Ct/ke(ke是末端消除速率常數(shù));t1/2按t1/2=0.693/ke求出;ke用對(duì)數(shù)血藥濃度—時(shí)間曲線末端直線部分的斜率求得。
　　 (2)測(cè)定人尿液中二甲雙胍和羅格列酮濃度:①樣品處理方法:向0.20mL待測(cè)尿液中分別加入50μL甲醇，50μL水，50μL

8、內(nèi)標(biāo)溶液(2.66μg/mL苯乙雙胍水溶液)，渦旋30s混勻;加400μL0.1％甲酸的乙腈溶液，渦旋30s混勻;離心15min(13000rpm)，取上清液700μL加入水600μL，渦旋30s混勻，取5μL進(jìn)樣分析。②質(zhì)譜分析:二甲雙胍、羅格列酮和內(nèi)標(biāo)苯乙雙胍在正離子檢測(cè)模式下，采用ESI源，主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，分別為m/z130.1、m/z358.2和m/z206.3。選擇性對(duì)準(zhǔn)分子離子[M+H]+進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分

9、析，獲得二甲雙胍和羅格列酮的主要碎片為m/z60.1和m/z134.9，響應(yīng)較強(qiáng)，比較穩(wěn)定且背景噪音低，因而被選作MRM定量的產(chǎn)物離子，用于定量分析。苯乙雙胍生成的主要碎片離子為m/z59.9，將m/z59.9作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。③色譜條件為:色譜柱:ZorbaxEclipseC18柱(50mm×2.1mmI.D，3.5μm，美國(guó)安捷倫公司);流動(dòng)相:乙腈∶0.1％甲酸+10mmol/L醋酸銨水溶液=20∶80(v/v);流速

10、:0.25mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:5μL。④受試者的選擇:“申請(qǐng)藥物臨床試驗(yàn)報(bào)告、試驗(yàn)方案、健康志愿者知情同意書(shū)”經(jīng)藥品臨床研究基地醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇健康志愿受試者10名，男女各半，年齡20～27歲，體重42～70kg，簽署知情同意書(shū)。于試驗(yàn)前在醫(yī)院接受全面的體格檢查，對(duì)肝、腎功能進(jìn)行化驗(yàn)測(cè)定，并進(jìn)行心電圖檢查，正常者方可入選。受試者無(wú)既往病史，平時(shí)很少服藥，不嗜煙酒，試驗(yàn)前14天內(nèi)未用任何藥物。臨床試驗(yàn)在醫(yī)院進(jìn)行，采血

11、期間禁煙酒、咖啡因類(lèi)飲料，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。⑤給藥方案及樣品采集與處理:10名受試者（男女各半），晚上統(tǒng)一清淡飲食，于試驗(yàn)前一天晚8:00開(kāi)始禁食，試驗(yàn)當(dāng)日早晨6:00空腹站立位口服羅格列酮鹽酸二甲雙胍片（含二甲雙胍500mg和羅格列酮2mg，200mL溫開(kāi)水送服），服藥后2h內(nèi)不得飲水，不得臥下，服藥后2h可飲水，4h后統(tǒng)一進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐（低脂肪飲食）。給藥后0-2、2-4、4-6、6-8、8-12、12-24h的尿液，每時(shí)間段尿液充分混合后量

12、取尿液總體積，并取5mL尿液存于-20℃冰箱中冷凍保存，用于尿藥濃度檢測(cè)。⑥尿液樣品分析:未知尿液樣品的測(cè)定按“尿液樣品的分析方法”項(xiàng)下操作，每天建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)分析低、中、高（雙樣本）的質(zhì)控樣品，并以同批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣品中二甲雙胍和羅格列酮濃度和質(zhì)控樣品的濃度，由QC樣品的結(jié)果決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍，QC樣品的相對(duì)偏差應(yīng)在±15％范圍之內(nèi)。⑦將各受試者不同時(shí)間的尿樣中藥物濃度數(shù)據(jù)及平均值與標(biāo)準(zhǔn)差列表并作圖;然后分別對(duì)每個(gè)受

13、試者的尿藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)求算，并求出參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。t1/2按t1/2=0.693/ke求出;ke用對(duì)數(shù)尿藥濃度—時(shí)間曲線末端直線部分的斜率求得。
　　 結(jié)果:
　　 血漿中比伐盧定的線性范圍分別為1.006-2011ng/mL，定量下限為1.006ng/mL。日內(nèi)精密度為3.2％～5.8％，日間精密度分別為6.0％～9.5％，準(zhǔn)確度分別為2.7％～7.8％。30名健康受試者單劑量注射低、

14、中、高三個(gè)劑量比伐盧定注射液后，血漿中的比伐盧定Tmax分別為0.091±0.021h,0.1±0.035h,0.1±0.053h;Cmax分別為2016.5±535.97ng/mL,3788.8±797.7ng/mL,6759±1959.4ng/mL;t1/2分別為0.66±0.14h,0.55+0.30h,0.75+0.41h;用梯形法計(jì)算，AUC0-t分別為909.0±152.3μg·h/mL，1755.8±235.5μg·h/m

15、L，3135.4±350.9μg.h/mL;AUC0-∞分別為955.7+146.9μg·h/mL,1798.1+248.7μg·h/mL,3199.3±378.4μg.h/mL。尿液中的二甲雙胍和羅格列酮的線性范圍為202-20200ng/ml和1.054-263.5ng/mL，定量下限分別為202.0ng/mL和1.054ng/mL。日內(nèi)精密度分別為3.7％～5.8％和4.7％～5.2％，日間精密度分別為1.9％～14.7％和8.3

16、％～14.7％，準(zhǔn)確度分別為-5.7％～0％和-4.8％～3.1％。10名受試者單劑量口服500mg二甲雙胍和2mg羅格列酮后，在尿液中未檢測(cè)到羅格列酮原型藥物，二甲雙胍主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，t1/2為3.1±0.5h，尿排率為31.846±18.517％。
　　 結(jié)果表明，HPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中比伐盧定和尿液中的二甲雙胍及羅格列酮已取得令人滿意的結(jié)果。首先測(cè)定血漿中比伐盧定和尿液中二甲雙胍及羅格列酮，每一樣品的測(cè)試時(shí)間僅

17、需4.5min和3.0min，使得樣品通量大大提高，每日能分析250～300個(gè)生物樣品;其次MRM技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)母離子和具有特征反應(yīng)的子離子;母離子被碰撞，特定子離子被選擇監(jiān)測(cè)，顯著降低了背景噪音，因而具有高度的專(zhuān)屬性和靈敏度。此外實(shí)驗(yàn)中對(duì)樣品前處理為乙腈蛋白沉淀，該方法簡(jiǎn)便，快捷，經(jīng)濟(jì)符合藥代動(dòng)力學(xué)高通量的需求。而且防止了內(nèi)源性物質(zhì)在色譜柱上的蓄積，延長(zhǎng)了色譜柱使用壽命。
　　 結(jié)論:
　　 本文所建立的HPLC-M