用HPLC-MS-MS法進(jìn)行nodosin在大、小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、研究背景:
　　唇形科(Labiatae)香茶菜屬（Isodon）植物系多年生草本、灌木或半灌木植物，全屬約計(jì)150余種，供藥用的有30余種，具有清熱解毒、健脾活血、抗菌消炎等功效，某些種類民間作為抗癌藥用。生物活性研究結(jié)果表明該屬植物具有的生物活性廣泛，從中提取分離得到的多個(gè)二萜類成分具有顯著的抗腫瘤活性。顯脈香茶菜Isodon neivosus(Hemsl.)C.Y.Wu et H.W.Li系唇形科香茶菜屬多年生草本植物，民間

2、以全草入藥，具有清熱、除濕、解毒等功效。從顯脈香茶菜中分離出的一系列二萜類化合物中，屬于α-亞甲基環(huán)戊酮單元對(duì)映-貝殼杉烷型的二萜類化合物顯示出良好的抗腫瘤活性。
　　Nodosin，為6，7斷裂-對(duì)映-貝殼杉烷型五環(huán)二萜化合物，是從顯脈香茶菜中分離出的天然對(duì)映-貝殼杉烷型二萜，對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病K512細(xì)胞、人白血病HL60細(xì)胞、人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞、小鼠B16-F10黑色素

3、瘤細(xì)胞、急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞PC-3均具有不同程度的抑制或殺傷作用。
　　Nodosin對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也具有明顯的選擇性抑制作用并對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有細(xì)胞增殖抑制作用，對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的IC50分別是25.81μM、11.05μM。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)這種作用通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期以及下調(diào)cyclinBl和cdc2蛋白水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，nodosin具有誘導(dǎo)膠質(zhì)

4、瘤細(xì)胞凋亡的作用，并能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞微管解聚以及下調(diào)MMP-9蛋白水平來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲。同時(shí)，前期研究首次在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)nodosin能抑制裸鼠內(nèi)膠質(zhì)瘤的腫瘤生長(zhǎng)及減少腫瘤重量，具有體內(nèi)抗惡性膠質(zhì)瘤作用。
　　到目前為止，有關(guān)單體化合物nodosin在體內(nèi)的吸收、代謝等相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)特征尚不清楚。為滿足新藥的研究與開(kāi)發(fā)需要，本課題建立了利用HPLC-MS/MS測(cè)定生物樣品中nodosin含量的方法，用以對(duì)nodosin在

5、大、小鼠體內(nèi)開(kāi)展系統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)探索性研究。
　　研究目的:
　　本項(xiàng)研究目的在于在本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)nodosin體內(nèi)、外抗惡性膠質(zhì)瘤的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行nodosin在小鼠體內(nèi)的吸收、分布及在大鼠體內(nèi)的吸收、排泄研究，探索nodosin的藥代動(dòng)力學(xué)。首先通過(guò)HPLC-MS/MS手段建立一個(gè)簡(jiǎn)單、靈敏專屬性強(qiáng)的測(cè)定生物樣品中nodosin含量的方法，利用此方法測(cè)定大、小鼠的血藥濃度來(lái)研究nodosin的吸收及其相關(guān)的藥代動(dòng)

6、力學(xué)參數(shù);其次通過(guò)測(cè)定小鼠肝臟及腦組織中nodosin的含量來(lái)研究其在肝臟里面藥物的分布情況及其是否透過(guò)血腦屏障;最后通過(guò)測(cè)定大鼠尿液和糞便中nodosin的含量來(lái)掌握其排泄情況。
　　研究方法
　　首先實(shí)驗(yàn)選擇齊墩果酸作為內(nèi)標(biāo)化合物并優(yōu)化色譜及質(zhì)譜條件，建立一個(gè)HPLC-MS/MS測(cè)定生物樣品中nodosin含量的方法。利用液液萃取法進(jìn)行生物樣品的前處理，考察不同的萃取溶劑、溶劑量及萃取時(shí)間對(duì)液液萃取法進(jìn)行優(yōu)化，參考文獻(xiàn)考

7、察在樣品處理過(guò)程中對(duì)基質(zhì)效應(yīng)及回收率影響的因素，得到最優(yōu)的樣品處理方法，最后進(jìn)行專屬性、精密度、回收率等方法學(xué)驗(yàn)證。
　　其次進(jìn)行大、小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)SD大鼠和KM小鼠單次腹腔注射nodosin生理鹽水(1 mg·kg-1)，給藥后于不同時(shí)間點(diǎn)（段）采集生物樣品，并用LC-MS/MS測(cè)定生物樣品中nodosin的濃度，最后通過(guò)DAS3.2.6藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算nodosin藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　研究結(jié)果:
　　(1)建立

8、了一個(gè)靈敏度高、專屬性強(qiáng)的HPLC-MS/MS測(cè)定生物樣品中nodosin含量的方法。結(jié)果顯示nodosin在3.9～1000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2＞0.99)，定量限為3.9 ng·mL-1。提取回收率在74.2％以上，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于9.8％，準(zhǔn)確度RE范圍在-1.6％～10.8％之間。表明該方法靈敏度和準(zhǔn)確度高，成熟穩(wěn)定，能夠滿足分析大量樣品的需要。
　　(2)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定了nodosi