IgA腎病尿蛋白質(zhì)譜HPLC-MS-MS的初步分析.pdf

1、目的：研究IgA腎病患者尿液蛋白質(zhì)譜特點，結(jié)合腎活檢技術(shù)對不同病理類型及IgA腎病的不同階段的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行比較，尋找具有高度特異性與敏感性的尿液蛋白質(zhì)，探討蛋白質(zhì)譜技術(shù)對該疾病的臨床診斷意義。 方法：取8例清晨空腹無菌尿液標(biāo)本，避免污染和蛋白質(zhì)酶解，進(jìn)行4℃3000×g離心5分鐘以除去細(xì)胞及相關(guān)成分，取上清液用0．45μm的微孔超濾膜過濾以除去大顆粒雜質(zhì)，再用-20℃預(yù)冷丙酮按照標(biāo)本體積：丙酮體積為4：1的比例迅速加入進(jìn)行蛋白沉

2、淀，置于-20℃過夜后，經(jīng)4℃7000×g高速離心30分鐘，棄上清液，留取含尿蛋白的沉淀物，-106℃真空干燥濃縮。PBS充分溶解后用Bradford法（考馬斯亮藍(lán)）進(jìn)行濃度測定，計算出樣品的蛋白濃度，取0．8g樣品充分酶解后調(diào)整蛋白濃度為0．8μg/μl，行HPLC除鹽，測得肽峰，獲取含肽混合液，-106℃真空干燥濃縮，再行LC-MS/MS（LCQ）質(zhì)譜分析，設(shè)定二級質(zhì)譜質(zhì)/荷優(yōu)化范圍為400-2000，質(zhì)譜分析時間210分鐘，洗脫時

3、間30分鐘，獲得質(zhì)譜肽序列結(jié)果采用BioWorks軟件的SEQUEST計算方法行數(shù)據(jù)庫檢索，所用的庫為ipi．human，v3．05。 結(jié)果：成功的獲得了重復(fù)性比較好的尿液蛋白質(zhì)譜肽序列圖譜，獲得IgA腎病尿蛋白質(zhì)共194個，不同病理類型患者的尿蛋白質(zhì)中有15個具有高度特異性的蛋白質(zhì)，在International Protein Index（IPI）human數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得13種蛋白質(zhì)；病理分型為局灶節(jié)段硬化型（Lee氏Ⅲ型）

4、有28種特征表達(dá)的蛋白質(zhì)，局灶增生硬化型（Lee氏Ⅱ型）有36種特征蛋白質(zhì)表達(dá)；病理類型為中度系膜增生型（Lee氏Ⅰ型）患者應(yīng)用激素治療2月后患者的尿蛋白臨床定量明顯減少，但蛋白質(zhì)譜鑒定其種類無明顯減少，治療前后有36種共同表達(dá)蛋白質(zhì)。 結(jié)論：本實驗采用LC-MS/MS質(zhì)譜分析的方法鑒定IgA腎病尿液蛋白質(zhì)，成功的獲得了該疾病的多肽序列質(zhì)譜圖，最終得到194個蛋白質(zhì)。大多數(shù)是糖蛋白；尿液蛋白質(zhì)組中的免疫球蛋白分泌片段、結(jié)合珠蛋白