加熱洗脫硝酸纖維膜上保存的尿蛋白質(zhì)及尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究.pdf

1、生物標(biāo)志物指的是與生理或病理生理過程相關(guān)的可監(jiān)測(cè)的變化，其本質(zhì)是變化。血漿作為機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，受穩(wěn)態(tài)機(jī)制調(diào)節(jié)各種理化成分保持相對(duì)恒定;而尿液作為機(jī)體的代謝廢物，包含更多反映機(jī)體變化的信息，即尿液可能是比血液更好的挖掘生物標(biāo)志物的來(lái)源。尿液作為重要的生物樣本，將其與臨床病歷在疾病的每個(gè)階段一起保存下來(lái)，那么在尋找生物標(biāo)志物的前瞻性研究中，特別是在大規(guī)模臨床驗(yàn)證試驗(yàn)中，將起到非常重要的作用。隨著用硝酸纖維膜保存尿蛋白質(zhì)方法的建立，

2、將尿蛋白質(zhì)吸附在硝酸纖維膜上、干燥后真空保存，這使低成本、大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間保存尿液樣本成為可能。
　　用硝酸纖維膜保存尿蛋白質(zhì)對(duì)于生物標(biāo)志物的研究意義重大，但是如何有效地從保存尿蛋白質(zhì)的膜上將蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，直接決定著該保存方法的被接受程度和應(yīng)用范圍。然而現(xiàn)有的強(qiáng)烈渦旋洗脫方法需要將每一個(gè)樣品強(qiáng)烈渦旋至少10 min才能使硝酸纖維膜完全溶解、而且干燥蛋白質(zhì)沉淀時(shí)硝酸纖維膜易再次形成，這使洗脫過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低，從而束縛了用硝酸纖維

3、膜保存尿蛋白的應(yīng)用。
　　針對(duì)以上問題本論文提出了加熱洗脫蛋白質(zhì)的方法:通過提高硝酸纖維膜溶解時(shí)的溫度，縮短了強(qiáng)烈渦旋時(shí)間、簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)洗脫步驟、有效防止了硝酸纖維膜的再形成，并且比強(qiáng)烈渦旋洗脫方法獲得更多的蛋白質(zhì)(P＜0.05)，SDS-PAGE分析，加熱洗脫法并沒有讓蛋白質(zhì)發(fā)生降解。LC-MS/MS分析加熱洗脫方法和直接丙酮沉淀方法制備的蛋白質(zhì)樣品，質(zhì)譜所鑒定到蛋白質(zhì)重疊率無(wú)明顯差異(分別是92.6％，96.8％)，蛋白質(zhì)豐度

4、CV值＜20％的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例均很高（分別是85.2％，94.4％)。加熱洗脫法具有很好的技術(shù)重復(fù)性，操作更加高效、簡(jiǎn)單，有利于用膜保存尿蛋白質(zhì)方法的推廣應(yīng)用。
　　蛋白質(zhì)翻譯后修飾能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能，從而在發(fā)育、代謝、疾病等眾多生物學(xué)過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此，在翻譯后修飾層面尋找標(biāo)志物可能比單純?cè)诘鞍踪|(zhì)層面獲得更多信息。相對(duì)于已知的400多種翻譯后修飾，目前對(duì)尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模研究依舊局限在磷酸化和糖

5、基化的領(lǐng)域，我們對(duì)尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾的認(rèn)識(shí)僅僅是冰山一角。
　　本論文對(duì)尿蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行了探索性研究，乙?；?、丙?；?、丁?；?、三甲基化、琥珀?；?、巴豆?；@幾個(gè)近幾年發(fā)現(xiàn)在機(jī)體生命活動(dòng)中起到重要調(diào)控作用的修飾，經(jīng)過Western Blot分析，結(jié)果顯示在正常人尿蛋白質(zhì)上均存在。為了進(jìn)一步探索在不同的腎臟疾病狀態(tài)下，這幾種翻譯后修飾上是否存在差異，我們對(duì)比了惡性高血壓腎臟損傷、膜性腎病、IgA腎病、狼瘡性腎炎、紫癜性腎病和正常