蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

1、二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。（20種aa的平均分子量為110）蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, 從大約6000到1’000’000道爾頓甚至更大。,§1.3蛋白質(zhì)的分類及化學(xué)結(jié)構(gòu),1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次:primary s

2、tructure 一級(jí)結(jié)構(gòu)： 氨基酸序列secondary structure 二級(jí)結(jié)構(gòu)： α螺旋，β折疊tertiary structure 三級(jí)結(jié)構(gòu)： 所有原子空間位置 quanternary structure 四級(jí)結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)多聚體 1969年正式將一級(jí)結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和二硫鍵的位置。 介于

3、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對(duì)獨(dú)立的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體）這兩個(gè)層次。,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次,1 多肽,一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。,多肽的結(jié)構(gòu),由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。,肽鍵將氨基酸與氨基酸頭尾相連,肽鏈中的肽平面,,肽鍵平面,肽鍵,肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與

4、羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。,,兩個(gè)肽平面以一個(gè)Cα為中心發(fā)生旋轉(zhuǎn),在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為多肽的氨基酸順序。通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的?-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的?-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列

5、順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln多肽的命名取從N-端的氨基酸殘基開始，稱：某氨酰某氨酰┅ ┅某氨基酸。,四肽的結(jié)構(gòu),多肽的性質(zhì),（1）. 多肽的兩性離解 肽在水溶液中是以兼性離子存在的,肽的亞氨基不能解離，因此肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈 N端和C端的自由NH2、自由羧基以及R基上可解離的官能團(tuán)。,多肽的性質(zhì),（2）.pK值和pH值 肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.

6、肽中N端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，R基的解離和氨基酸差不多。 pI：肽所帶的凈電荷為零時(shí)溶液的pH。 小肽（2—5肽）的pI值的求法，先寫解離式，找兩性離子，把兩性離子兩邊的pK值相加除2即得。大肽不能用此法求。,（3）.旋光性 蛋白質(zhì)水解所得的各種肽，酶解時(shí)不發(fā)生消旋，就具有旋光性。 一般短肽的旋光度約等于組成該肽的各個(gè)氨基酸旋光度之和. 大肽和蛋白質(zhì)的旋光度一般大于組成該肽的各

7、個(gè)氨基酸旋光度之和.,多肽的性質(zhì),(4) 顏色反應(yīng),多肽可與多種化合物作用，產(chǎn)生不同的顏色反應(yīng)。這些顯色反應(yīng)，可用于多肽的定性或定量鑒定。如茚三酮反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)。黃色反應(yīng)，是由硝酸與氨基酸的苯基（Tyr、Phe和Trp）反應(yīng)生成硝基苯衍生物而顯黃色。,多肽的性質(zhì),硝基酚(黃色) 鄰硝醌酸鈉(橙黃色),多肽的雙縮脲反應(yīng)是多肽特有的顏色反應(yīng);雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。雙縮脲能夠與堿性硫酸

8、銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個(gè)以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測(cè)定的重要反應(yīng)。,尿素 雙縮脲 紫紅色絡(luò)合物,天然存在的重要多肽,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的肽以游離狀態(tài)存在。這類肽通常都具有特殊的生理功能

9、，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val ?

10、 ? L-Orn L-Orn ? ? L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu  短桿菌肽S(環(huán)十肽)  由細(xì)菌

11、分泌的多肽，有時(shí)也都含有D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine, 縮寫為 Orn）。,習(xí)題：,等電點(diǎn)計(jì)算： 有一個(gè)蛋白質(zhì)擁有30個(gè)側(cè)鏈羧基（pKa 4.3），10個(gè)咪唑基團(tuán)（pKa 7.0），15個(gè) ε-氨基（pKa 10.0）。 求該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,2 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary structure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場(chǎng)合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸

12、順序。多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬(wàn)個(gè)不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。,1 樣品必需純（>97%以上）；2 知道蛋白質(zhì)的分子量；3 知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；4 測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。5

13、 測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。,測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求,蛋白質(zhì)和多肽氨基酸順序的測(cè)定,(1)、肽鏈的拆開和分離 (2)、測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 (3)、二硫鍵的斷裂 (4)、測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比 (5)、N端、C端的測(cè)定 (6)、多肽鏈斷裂 (7)、測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。 (8)、確定肽段在多肽鏈中的次序。 (9)、確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。,酸水解,常用6

14、mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時(shí)間約20小時(shí)。此法的優(yōu)點(diǎn)是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點(diǎn)是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。,堿水解,一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)。由于水解過(guò)程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸在水解中不受

15、破壞。,酶水解,目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。應(yīng)用酶水解多肽不會(huì)破壞氨基酸，也不會(huì)發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。,測(cè)定步驟,(1) 多肽鏈的拆分。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,測(cè)定步驟,幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L

16、尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,測(cè)定步驟,(2) 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,測(cè)定步驟,(3) 二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的?-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，

17、以防止它重新被氧化。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,二硫鍵的切割與保護(hù),1、過(guò)甲酸〔performic acid〕 不可逆 －CH2SO3H2、還原＋氧化 不可逆 [ 巰基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等 －S-CH2-COOH3、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

18、 －R1-S-S-R2 ＋ HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3,測(cè)定步驟,可以通過(guò)加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,,作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護(hù)。,巰基（-SH）的保護(hù),(4)測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比；,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,測(cè)定步驟,(5)分析多肽鏈的N-末端和C

19、-末端。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端氨基酸測(cè)定,N末端：1、Sanger法2、Edman法3、DNS-Cl4、酶降解法,C末端：1、肼解法2、酶降解法3、硼氫化鋰法,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作

20、用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。,末端氨基酸測(cè)定,① 二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger試劑(DNFB)標(biāo)記N末端,② Edman 降解法(I),Edman 降解法(II),氨基酸的鑒定、分離純化,PTH-AA,在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)

21、是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1?10-9mol。,末端氨基酸測(cè)定,③ 丹磺酰氯法,氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)地向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。,末端氨基酸測(cè)定,④ 氨肽酶法,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法

22、。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。,末端氨基酸測(cè)定,⑤ 肼解法,羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根具不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來(lái)自胰臟；C來(lái)自柑桔葉；Y來(lái)自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Ar

23、g和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵；Y都能水解。,末端氨基酸測(cè)定,⑥ 羧肽酶法,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽C-端氨基酸可被硼氫化鋰還原成α-氨基醇，用層析法可以鑒定氨基酸種類。,末端氨基酸測(cè)定,⑦ 硼氫化鋰,N末端和C末端的測(cè)序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究以外，最常用于基因工程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析。,測(cè)定步驟,(6) 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將

24、多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來(lái)。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,? 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶,酸性磷酸酶、彈性蛋白酶,多肽鏈的選擇性降解,? 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，酸性磷酸酶、彈性蛋白酶,多肽鏈的選擇性降解,Pepsin：R1和R2＝苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr); 亮氨酸(Leu)以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1不能為Pro。

25、,肽鏈,水解位點(diǎn),胃蛋白酶,肽鏈,水解位點(diǎn),嗜熱菌蛋白酶,thermolysin：R3=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。R2和 R4不能為Pro。,? 酶解法: 另外酸性磷酸酶、彈性蛋白酶也較常用,多肽鏈的選擇性降解,? 酶解法: 另外酸性磷酸酶、彈性蛋白酶也較常用,多肽鏈的選擇性降解,? 化學(xué)法 (Cyanogen bromide) ： 溴化氰水解法，它能

26、選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。,多肽鏈的選擇性降解,測(cè)定步驟,(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 結(jié)論：A B C D E,FDNB,FDNB,完

27、全水解,部分水解,一般測(cè)定步驟,(8)確定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 重疊法 －－－－－－－－－－－－－ 多肽↓ →→→→→ →→→→ →→→→→→ →→→→↓ 氨基酸序列,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,一般測(cè)定步驟,(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位

28、置。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,,,,,,,,,,,,,一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。,二硫鍵位置的確定,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例,蛋白質(zhì)中氨基酸順序的測(cè)定 用幾種酶或試劑把蛋白質(zhì)水解成大小不同的片段，找出重疊部分，確定順序。例1：有一個(gè)九肽，

29、 用胰蛋白酶水解得到：（1）Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,(2) Thr-Phe-Val-Lys; 用糜蛋白酶水解得到: (3)Val-Lys-Ala-Ala-Trp, (4)Thr-Phe, (5)Gly-Lys; 確定此九肽的氨基酸順序。,順序?yàn)椋篢hr-Phe-Val-Lys- Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,例2：有一肽鏈，用下述試劑降解后，結(jié)果如下：,1、酸解:(1)（

30、Ala,Asp,Glu2,Lys2,Met,Phe)2、羧肽酶A:(2)第一次降解出的aa是Glu3、胰蛋白酶:(3)(Glu,Lys) (4)(Asp,Lys,Phe) (5)(Ala,Glu,Met)4、CNBr水解: (6)(Asp,Glu,Lys2,Met,Phe) (7)(Ala,Glu)5、糜蛋白酶:(8)(Glu,Lys,Phe) (9)(Ala,Asp,Glu,Lys,Met),解: (1) 表明此肽是一個(gè)八肽

31、 (2) C端的氨基酸是Glu (3) Glu-Lys- (4)_ _ Lys(胰蛋白酶) (5)_ _ Glu(位于C端) (6)_ _ _ _ _-Met (7)由(5)可知Met-Ala-Glu (8)由(3)可知Glu-Lys-Phe (9)由(7)可知_ _ -Met-Ala-Glu,由(

32、8)知Glu-Lys-Phe,所以,(4)順序?yàn)?Phe-Asp-Lys,此肽的aa順序?yàn)?Glu-Lys-Phe- Asp-Lys -Met-Ala-Glu,例3：有一肽鏈，用下述試劑降解后，結(jié)果如下：,1、酸解:(1) Ala2,Arg,Lys2,Met,Phe,Ser22、羧肽酶A :(2)第一次降解出的aa是Ala3、胰蛋白酶:(3)(Arg,Ala) (4)(Lys,Phe,Ser) (5)(Lys) (6)(Ala,Me

33、t,Ser)4、CNBr水解: (7)(Ala,Arg,Lys2,Met,Phe,Ser) (8)(Ala,Ser)5、嗜熱菌蛋白酶:(9)(Ala,Arg,Ser) (10)(Ala,Lys2,Met,Phe,Ser),解: (1) 此肽是一個(gè)9肽 (2) C端的氨基酸是Ala (3) Ala-Arg- (4)_ _ Ly

34、s (5)Lys前面的AA是Lys或Arg (6)由(2)(3)(8)知Met-Ser-Ala (7)_ _ _ _ _ _Met (8)由(2)(3)知Ser-Ala (9)由(3)Ser在Ala-Arg之后，為Ala-Arg-Ser (10)由(5)(6) 知Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala,次肽的aa順序?yàn)? Ala-A