蛋白質的結構及功能

1、生物化學,Biochemistry and Molecular Biology,沈陽醫(yī)學院生物化學教研室,,緒 論,,生物化學就是生命的化學。它是研究活細胞和有機體中存在的各種化學分子及其所參與的化學反應的科學。,,一、生物化學發(fā)展簡史二、生物化學研究內容三、生物化學與醫(yī)學四、本課內容簡介,,生物化學研究內容,生物分子的結構與功能 物質代謝及其調節(jié) 遺傳信息的傳遞及其調控,,生物化學與醫(yī)學,生物化學的理論與技術已滲透到

2、醫(yī)學科學的各個領域 生物化學在生命科學中占有重要的地位 生物化學的發(fā)展促進了疾病病因、診斷和治療的研究,,本課內容簡介（一）蛋白質的結構與功能酶生物氧化糖代謝脂類代謝氨基酸代謝,,本課內容簡介（二）核酸的結構與功能核苷酸代謝　基因信息的傳遞細胞信息傳遞癌基因、抑癌基因與生長因子血液的生化,蛋白質的結構與功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,蛋白質(protei

3、n)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。,蛋白質的生物學重要性,1. 蛋白質是生物體的重要組成成分2. 蛋白質具有重要的生物學功能　1）作為生物催化劑　2）代謝調節(jié)作用　3）免疫保護作用　4）物質的轉運和存儲　5）運動與支持作用　6）參與細胞間信息傳遞3. 氧化供能,蛋白質的分子組成The Molecular Component of Protein,

4、第 一 節(jié),? 蛋白質的元素組成,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白質含有少量P或金屬元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，個別蛋白質還含有 I 。,蛋白質的含氮量平均為16％。,通過樣品含氮量計算蛋白質含量的公式：,蛋白質含量 ( g % ) = 含氮量( g % ) × 6.25,? 蛋白質元素組成的特點,一、氨基酸 ——蛋白質的基本組成單位,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基

5、酸僅有20種，且均屬 L-?-氨基酸（甘氨酸除外）。,非極性脂肪族氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,（一）氨基酸可根據側鏈結構和理化性質進行分類,1. 側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,2. 側鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸,3. 側鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸,4. 側鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸,5. 側鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸,,幾種特殊氨基酸Gly：無

6、手性碳原子。Pro：為環(huán)狀亞氨基酸。Cys：可形成二硫鍵。,,,修飾氨基酸：　　蛋白質合成后通過修飾加工生成的氨基酸。沒有相應的編碼。如：胱氨酸、羥脯氨酸（Hyp）、羥賴氨酸（Hyl）。非生蛋白氨基酸：　　蛋白質中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸，是代謝途徑中產生的。,（二）氨基酸的理化性質,1. 兩性解離及等電點,2. 紫外吸收,3. 茚三酮反應,二、肽,* 肽鍵(peptide bond)：是由一個氨基酸

7、的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,（一）肽(peptide),多肽鏈(polypeptide chain)二肽，三肽……寡肽(oligopeptide)，多肽(polypeptide)氨基酸殘基(residue)：肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。氨基末端（amino terminal）和羧基末端（carboxyl terminal）主鏈和側鏈,多肽鏈,,多

8、肽鏈,（二） 幾種生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),結構:,谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽谷氨酸的?-羧基形成肽鍵－SH為活性基團為酸性肽是體內重要的還原劑,GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,主要功能:,肽類激素：如促甲狀腺素釋放激素（TRH）,神經肽(neuropeptide),2. 肽類激素及神經肽,蛋 白 質 的 分 子 結 構The Molecular St

9、ructure of Protein,第 二 節(jié),蛋白質的分子結構包括： 一級結構 (primary structure)二級結構 (secondary structure)三級結構 (tertiary structure)四級結構 (quaternary structure),定義：蛋白質分子從N-端至C-端的氨基酸排列順序。,一、蛋白質的一級結構,主要化學鍵：肽鍵　　二硫鍵的位置屬于一級結構研究

10、范疇。,一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。,胰島素的一級結構,,30,21,二、蛋白質的二級結構,蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象 。,定義：,穩(wěn)定因素： 氫鍵,多肽鏈,（一）肽單元 (peptide unit),參與組成肽鍵的6個原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質構象的基本結構單位。,,肽單元,H,H,H,H,蛋白質二級結構的主要形

11、式,?-螺旋 ( ? -helix ) ?-折疊 ( ?-pleated sheet ) ?-轉角 ( ?-turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ),（二） ?-螺旋,結構要點: ①多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。 ②每圈螺旋含3.6個氨基酸，螺距為0.54nm。 ③每個肽鍵的氨基氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長軸基本平行。,,,（三）?-折疊,①多

12、肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結構，側鏈位于鋸齒結構的上下方。 ②兩段以上的β -折疊結構平行排列 ，兩鏈間可順向平行，也可反向平行 。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β -折疊結構。氫鍵與螺旋長軸垂直。,蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成?-螺旋或β-折疊，它就會出現相應的二級結構。,（四）?-轉角和無規(guī)卷曲,?-轉角：,無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構。,① 肽鏈內形成180&#

13、186;回折。②含4個氨基酸殘基，第一個殘基的羰基氧與第四個殘基的氨基氫形成氫鍵。③ 第二個氨基酸殘基常為Pro。,?-轉角：,,（五）模體是具有特殊功能的超二級結構,在許多蛋白質分子中，可發(fā)現二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結構組合，被稱為超二級結構。,細胞色素C的αα結構,細胞核抗原的βαβ結構,纖溶酶原的ββ結構,,模體,蛋白質分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個

14、具有特殊功能的空間構象，被稱為模體(motif)。,鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體 EF hand,α-螺旋-β轉角（或環(huán)）-α-螺旋模體,鋅指結構zinc finger DNA結合蛋白,α-螺旋-β折疊- β折疊模體,三、蛋白質的三級結構,疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等。,穩(wěn)定因素：,整條肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,定義,肌紅蛋白 (Mb) myoglobin,153 AA1 HemeA~H八段α-

15、螺旋無-S-S-鍵功能：儲存O2,結構域 (domain),分子量較大的蛋白質常可折疊成多個結構較為緊密的區(qū)域，并各行其功能，稱為結構域 (domain) 。,3-磷酸甘油醛脫氫酶,分子伴侶 (chaperon),通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構的一類蛋白質。,* 可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可使肽鏈正確折疊。 （粘扣帶）,* 與錯誤聚集的肽段結合，誘導其正確折疊。,* 對蛋白

16、質分子中二硫鍵的正確形成起重要的作用。,作用：,亞基之間的結合力主要是氫鍵和離子鍵。,四、蛋白質的四級結構,蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。,有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每條具有完整三級結構的多肽鏈，稱為亞基 (subunit)。,血紅蛋白（Hb）的四級結構,血紅蛋白的一、二、三、四級結構,一級結構：相鄰AA間的共價結合二級結構：短距離AA之間的非共價連接三級結構：遠距離AA

17、之間的非共價連接四級結構：多肽鏈之間的非共價連接,含有二條以上多肽鏈的蛋白質一定具有四級結構。,亞基之間的結合主要是氫鍵和離子鍵（非共價鍵）,只有一條多肽鏈的蛋白質肯定沒有四級結構。,多分子聚合物不屬于四級結構,,蛋白質結構與功能的關系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 節(jié),（一）一級結構是空間構象的基礎,一、蛋白質一級結構與功能的關系,,天然狀態(tài)，有催化活性,

18、尿素、β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,（二）一級結構與功能的關系,例：鐮刀形紅細胞貧血（Sickle Cell Anemia）,這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,使血紅蛋白的溶解度下降。在氧張力低的毛細血管區(qū),HbS形成凝膠化導致紅細胞扭曲、僵硬，不能通過毛細血管, 凝膠狀HbS使血液的黏滯度增大,阻塞毛細血管,引起局部組織器官缺血缺氧,產生脾腫大、胸腹疼痛。非洲40%攜帶，患者對瘧

19、疾的感染有顯著抵抗力。,（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構,二、蛋白質空間結構與功能的關系,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合， Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,,,,,* 協(xié)同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象

20、，稱為協(xié)同效應。 促進作用稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity)抑制作用稱為負協(xié)同效應(negative cooperativity),變構效應(allosteric effect),凡蛋白質（或亞基）因與某小分子物質相互作用而發(fā)生構象變化，導致蛋白質（或亞基）功能的變化，稱為蛋白質的變構效應。,（三）蛋白質構象改變與疾病,蛋白質構象?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)

21、生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可

22、轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。,PrPcα-螺旋,PrPscβ-折疊,正常,瘋牛病,,PrPcα-螺旋,PrPscβ-折疊,正常,瘋牛病,,第四節(jié),蛋白質的理化性質與分離純化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白質的兩性電離,一、理化性質,蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘

23、基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) 　　當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。,利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術分離蛋白質。,（二）蛋白質的膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子

24、的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。,* 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白質的聚沉,（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固,* 蛋白質的變性(denaturation)　　在某些物理和化學因素作用下，蛋白質分子的特定空間構象被破壞，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。,造成變性的因素：如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。

25、防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。,蛋白質變性后的性質改變：　　溶解度降低、粘度增加、結晶能力消失、生物活性喪失及易受蛋白酶水解。,若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性。,復性(renaturation),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,* 蛋白質沉淀　　在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽

26、鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。,* 蛋白質的凝固作用(protein coagulation) 　　蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,（四）蛋白質的紫外吸收,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。,（五）蛋白質的呈色反

27、應,⒈茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。 藍紫色,⒉雙縮脲反應(biuret reaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,二、蛋白質的分離和純化,（一）透析及超濾法,* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。,* 超濾法：應用正壓或離

28、心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,（三）電泳,蛋白質在高于或低于其pI的溶液

29、中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳：通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳：是蛋白質組學研究的重要技術。,（四）層析,層析(chromatography)分

30、離蛋白質的原理待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的 。,蛋白質分離常用的層析方法* 離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。* 凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析：利用各蛋白質分子大小不同分離。,（五）超速離心,* 超速離心法(ultra

31、centrifugation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。,*蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系數與蛋白質的密度和形狀相關 。,三、多肽鏈中氨基酸序列分析,1. 分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成,2. 測定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基,3. 把肽鏈水解成片段，分別進行分析,4. 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,5. 經