生物化學蛋白質的結構與功能

1、蛋白質的結構與功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,蛋白質(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。,蛋白質的生物學重要性,1. 蛋白質是生物體的重要組成成分2. 蛋白質具有重要的生物學功能　1）作為生物催化劑　2）代謝調節(jié)作用　3）免疫保護作用　4）物質的轉運和存儲　5）運動與支持作用　6）參與

2、細胞間信息傳遞3. 氧化供能,蛋白質的分子組成The Molecular Component of Protein,第 一 節(jié),? 蛋白質的元素組成,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白質含有少量P或金屬元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，個別蛋白質還含有 I 。,蛋白質的含氮量平均為16％。,通過樣品含氮量計算蛋白質含量的公式：,蛋白質含量 ( g % ) = 含氮量( g % ) × 6.25,? 蛋白

3、質元素組成的特點,一、氨基酸 ——蛋白質的基本組成單位,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且均屬 L-?-氨基酸（甘氨酸除外）。,非極性疏水性氨基酸極性中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,（一）氨基酸的分類,非極性疏水性氨基酸,2. 極性中性氨基酸,3. 酸性氨基酸,4. 堿性氨基酸,,習慣分類方法芳香族氨基酸：Trp、Tyr、Phe含羥基氨基酸：Ser、Thr、Tyr含硫氨基酸：Cy

4、s、Met雜環(huán)族氨基酸：His雜環(huán)族亞氨基酸：Pro支鏈氨基酸：Val、Leu、Ile,,幾種特殊氨基酸Gly：無手性碳原子。Pro：為環(huán)狀亞氨基酸。Cys：可形成二硫鍵。,修飾氨基酸：　　蛋白質合成后通過修飾加工生成的氨基酸。沒有相應的編碼。如：胱氨酸、羥脯氨酸（Hyp）、羥賴氨酸（Hyl）。非生蛋白氨基酸：　　蛋白質中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸，是代謝途徑中產(chǎn)生的。,（二）氨基酸的理化性質,

5、1. 兩性解離及等電點,2. 紫外吸收,3. 茚三酮反應,氨基酸的解離,氨基酸的等電點,當溶液為某一pH值時，AA主要以兼性離子的形式存在，分子中所含的正負電荷數(shù)目相等，凈電荷為0。這一pH值即為AA的等電點（pI）。在pI時，AA在電場中既不向正極也不向負極移動，即處于兩性離子狀態(tài)。,Ka1*Ka2=……,側鏈不含離解基團的中性AApI = (pK’1 + pK’2 )/2,甘氨酸滴定曲線,對于側鏈含有可解離基團的AApI取決于

6、兩性離子兩邊pK’值的算術平均值酸性AA：pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2 堿性AA：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2,氨基酸的光譜性質,可見光區(qū)：無吸收遠紫外和紅外區(qū)：都吸收近紫外區(qū)（200—400nm）：Tyr/Trp/Phe 原因：-C=C-C=C-C=C-C=C-,紫外吸收光譜,Trp 280nmTyr 275nmPhe 257nm,蛋白質含量測定,280nm,弱酸

7、 加熱,與茚三酮生成藍紫色化合物,二、肽,* 肽鍵(peptide bond)：是由一個氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,（一）肽(peptide),+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,,肽鍵有部分雙鍵性質,肽鍵由于共振而具有部分雙鍵性質，因此， 肽鍵比一般C-N鍵短，且不能自由旋轉 肽鍵原子及相鄰的a碳原子組成肽平面 相鄰的a碳原子呈反式構型,肽鍵比一般C-N鍵短,肽鍵為一平面,相鄰的a碳原子呈反式構

8、型,* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……,* 肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,* 由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,* 多肽鏈(polypep

9、tide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。,多肽鏈,,多肽鏈,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 幾種生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),結構:,谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽谷氨酸的?-羧基形成肽鍵－SH為活性基團為酸性肽是體內(nèi)重要的還原劑,GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,主要功能:,肽類激素：如促甲狀腺素釋放激素（TRH）,神經(jīng)肽(neu

10、ropeptide),2. 肽類激素及神經(jīng)肽,蛋 白 質 的 分 子 結 構The Molecular Structure of Protein,第 二 節(jié),蛋白質的分子結構包括： 一級結構 (primary structure)二級結構 (secondary structure)三級結構 (tertiary structure)四級結構 (quaternary structure),定義：蛋白質的

11、一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。,一、蛋白質的一級結構,主要化學鍵：肽鍵　　二硫鍵的位置屬于一級結構研究范疇。,一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。,胰島素的一級結構,,30,21,二、蛋白質的二級結構,蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象 。,定義：,穩(wěn)定因素： 氫鍵,（一）肽單元 (peptide unit),參與組成肽鍵的6個原子位于同一平面，又

12、叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質構象的基本結構單位。,,肽單元,H,H,H,H,蛋白質二級結構的主要形式,?-螺旋 ( ? -helix ) ?-折疊 ( ?-pleated sheet ) ?-轉角 ( ?-turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ),（二） ?-螺旋,?-螺旋結構要點: ①多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。 ②每圈螺旋含3.6個氨基酸，螺距為0.54nm。 ③

13、每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長軸基本平行。,（三）?-折疊,①多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結構，側鏈位于鋸齒結構的上下方。 ②兩段以上的β -折疊結構平行排列 ，兩鏈間可順向平行，也可反向平行 。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β -折疊結構。氫鍵與螺旋長軸垂直。,（四）?-轉角和無規(guī)卷曲,?-轉角：,無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構。,① 肽鏈內(nèi)形成180º回折

14、。②含4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。③ 第二個氨基酸殘基常為Pro。,?-轉角：,超二級結構(supersecondary structure) 超二級結構：是指在多肽鏈內(nèi)順序上相互靠近的二級結構常常在空間折疊中彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結構聚合體。它是蛋白質構象中二級和三級結構之間的一個層次，故稱超二級結構。通常類型有： 1、?? 2、??

15、 3、???,,?? ?? ???,,（五）模體,蛋白質分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個具有特殊功能的空間構象，被稱為模體(motif)。,螺旋－環(huán)－螺旋,鋅指,,（六）影響二級結構形成的因素,氨基酸側鏈所帶電荷 、大小及形狀。,影響α-螺旋形成的因素：,β -折疊形成條件：　　要求氨基酸側鏈較小。,三、蛋白

16、質的三級結構,疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等。,穩(wěn)定因素：,整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,定義,肌紅蛋白 (Mb),,纖連蛋白分子的結構域,結構域 (domain),大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結構域。,結構域約含100-200個氨基酸殘基，各自有獨特的空間夠象，并承擔不同的生物學功能。,輕鏈,抗體

17、分子中結構域示意圖,重鏈,四種類型結構域示意圖,反平行?,反平行?,平行?/ ?,小的不規(guī)則結構,結構域,,Triose phosphate isomerase,分子伴侶 (chaperon),通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構的一類蛋白質。,* 可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可使肽鏈正確折疊。,* 與錯誤聚集的肽段結合，誘導其正確折疊。,* 對蛋白質分子中二硫鍵的正確形成起重要的作用

18、。,作用：,亞基之間的結合力主要是氫鍵和離子鍵。,四、蛋白質的四級結構,蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。,每條具有完整三級結構的多肽鏈，稱為亞基 (subunit)。,血紅蛋白（Hb）的四級結構,,從一級結構到四級結構,血紅蛋白,蛋白質的一級結構是它的氨基酸序列,蛋白質的二級結構是由氫鍵導致的肽鏈卷曲與折疊,Primarystructure,Secondarystructure,蛋白

19、質的三級結構是多肽鏈自然形成的三維結構,蛋白質的四級結構是亞基的空間排列,Polypeptide(single subunitof transthyretin),Transthyretin, with fouridentical polypeptide subunits,Tertiarystructure,Quaternarystructure,五、蛋白質的分類,* 根據(jù)蛋白質組成成分,* 根據(jù)蛋白質形狀,雙向電泳,六、蛋白質

20、組學二維電泳,蛋白質結構與功能的關系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 節(jié),（一）一級結構是空間構象的基礎,一、蛋白質一級結構與功能的關系,,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,（二）一級結構與功能的關系,例：鐮刀形紅細胞貧血,這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,,,,,,,,,,,,,,

21、,,,,,,,,狗人猴,馬騾,鯨 兔豬,袋鼠,企鵝,雞 鴨,響尾蛇,龜,蒼蠅 蛾,脈孢菌屬,念珠菌屬,面包酵母菌,小麥,牛 蛙,金槍魚,動 物,爬行動物,兩棲動物,,魚,哺乳動物,鳥,昆 蟲,植 物,脊椎動物,從細胞色素C的一級結構看生物進化,（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構,二、蛋白質空間結構與功能的關系,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合， Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度

22、變化而改變。,（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,* 協(xié)同效應(cooperativity),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 促進作用稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity)抑制作用稱為負協(xié)同效應(negative cooperativity),,,血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小

23、，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,變構效應(allosteric effect),凡蛋白質（或亞基）因與某小分子物質相互作用而發(fā)生構象變化，導致蛋白質（或亞基）功能的變化，稱為蛋白質的變構效應。,（三）蛋白質構象改變與疾病,蛋白質構象?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣

24、纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。,PrPcα-螺旋,PrPscβ-折疊,正常,瘋牛病,,第四節(jié),蛋白質的理化性

25、質與分離純化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白質的兩性電離,一、理化性質,蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) 　　當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質

26、解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。,利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術分離蛋白質。,（二）蛋白質的膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。,* 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白質的聚沉,（三）蛋白質的變性、沉淀和凝固,* 蛋白質的變性(denatu

27、ration)　　在某些物理和化學因素作用下，蛋白質分子的特定空間構象被破壞，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。,造成變性的因素：如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。,蛋白質變性后的性質改變：　　溶解度降低、粘度增加、結晶能力消失、生物活性喪失及易受蛋白酶水解。,若蛋白質變性程度較輕

28、，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性。,復性(renaturation),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,* 蛋白質沉淀　　在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。,* 蛋白質的凝固作用(protein coagulation) 　　蛋白質變性后

29、的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,（四）蛋白質的紫外吸收,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。,（五）蛋白質的呈色反應,⒈茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。,⒉雙縮脲反應(biuret reaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在

30、稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,二、蛋白質的分離和純化,（一）透析及超濾法,* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。,* 超濾法：應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白

31、質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,*免疫沉淀法：　　　將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,（三）電泳,蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在

32、電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳：通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳：是蛋白質組學研究的重要技術。,（四）層析,層析(chromatography)分離蛋白質的原理

33、待分離蛋白質溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質的目的 。,蛋白質分離常用的層析方法* 離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。* 凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析：利用各蛋白質分子大小不同分離。,（五）超速離心,* 超速離心法(ultracentrifug

34、ation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。,*蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關 。,三、多肽鏈中氨基酸序列分析,1. 分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成,2. 測定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基,3. 把肽鏈水解成片段，分別進行分析,4. 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,5. 經(jīng)過組合排列對比，最