利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測(cè)膜性腎病腎組織蛋白質(zhì).pdf

1、背景及目的：膜性腎病(Membranous nephropathy,MN)是一種自身免疫異常所致的原發(fā)性腎臟病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前已有研究證實(shí)，抗M型磷脂酶A2受體抗體(Anti-M-type Phospholipase A2Receptor，Anti-PLA2R)是70％左右的膜性腎病患者血液中的特異性自身抗體，但是自身抗體如何對(duì)腎小球局部產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致膜性腎病患者腎臟的病理生理變化仍不清楚。我們推測(cè)，細(xì)胞因子等參與細(xì)胞間信

2、號(hào)傳遞的活躍小分子低豐度蛋白質(zhì)在膜性腎病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究技術(shù)目前主要分為兩大類，一類是質(zhì)譜技術(shù)，另一類為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。因腎組織中的小分子低豐度蛋白質(zhì)的響應(yīng)值常難以達(dá)到質(zhì)譜的檢測(cè)低限，故本研究采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。本研究旨在利用合適的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選膜性腎病腎臟組織中的小分子低豐度蛋白質(zhì)，尋找并闡述可能參與膜性腎病發(fā)病的信號(hào)通路途徑，為深入研究膜性腎病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　材料及方法：(1)

3、為尋找適合于腎臟組織檢測(cè)的蛋白質(zhì)芯片，本研究第一部分使用分別使用三種芯片——定量芯片QAH-INF-3和半定量芯片L-493及L-507對(duì)正常腎臟組織進(jìn)行檢測(cè)并評(píng)價(jià)其可用性。正常腎臟組織來源于腎細(xì)胞癌患者手術(shù)切除后的癌旁正常腎臟組織。研究使用三種芯片分別對(duì)同一樣本的2∶1倍比稀釋液進(jìn)行檢測(cè)，將所測(cè)得倍比稀釋樣品的信號(hào)值比介于1.3-3.0之間的蛋白質(zhì)定義為可檢測(cè)蛋白質(zhì)，通過三種芯片所測(cè)得的可檢測(cè)蛋白質(zhì)的數(shù)量及比例來評(píng)價(jià)芯片的可用性。

4、r>　　(2)本研究第一部分發(fā)現(xiàn)芯片L-493更適合于腎臟組織小分子低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)，在第二部分中，使用芯片L-493分別對(duì)3例膜性腎病腎臟組織與3例正常腎臟組織進(jìn)行檢測(cè)。將所測(cè)MN/N信號(hào)值比＞1.35的蛋白質(zhì)定義為差異蛋白質(zhì)，對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析，并篩選與膜性腎病發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及免疫組織化學(xué)染色方

5、法(Immunohistochemical staining，IHC)對(duì)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較高的蛋白質(zhì)CTSD，EpCAM，ADAMTS-4及CD46等進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果及結(jié)論：(1)芯片可用性評(píng)價(jià)：芯片QAH-INF-3的可檢測(cè)蛋白質(zhì)共9種(22.5％)，芯片L-507中的可檢測(cè)蛋白質(zhì)共61種(12.03％)，芯片L-493的可檢測(cè)蛋白質(zhì)共214種(43.41％)。芯片L-493的可檢測(cè)蛋白質(zhì)的種類及數(shù)量均最多，更適合用來檢測(cè)腎臟組

6、織中的小分子低豐度蛋白質(zhì)。
　　(2)膜性腎病差異蛋白質(zhì)檢測(cè)分析：芯片L-493共檢測(cè)到膜性腎病差異蛋白質(zhì)66種，基因本體(Gene ontology,GO)分析與蛋白質(zhì)間相互關(guān)系(Protein-protein interaction，PPI)分析發(fā)現(xiàn)了多種可能與膜性腎病相關(guān)的信號(hào)通路，例如免疫活化、細(xì)胞代謝、細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)等。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)的功能多樣化，在各信號(hào)通路間扮演“樞紐”蛋白質(zhì)的角色，