蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)群的分析.pdf

1、研究背景： 移植排斥是角膜移植術(shù)失敗的主要原因，尤其是植床上有大量新生血管的高危角膜移植患者，移植后排斥反應(yīng)發(fā)生早且嚴(yán)重，移植物常被破壞。在局部或全身應(yīng)用免疫抑制劑的情況下，角膜植片的存活率仍小于35％，這已成為目前亟待解決的問題。該反應(yīng)是一多因素參與的復(fù)雜過程，影響因素具有廣泛性和交叉性. 蛋白質(zhì)組是一個基因組所能編碼的所有蛋白的組合。蛋白質(zhì)組學(xué)是對一個基因組、一種生物、一種細(xì)胞、組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其相互作用的研

2、究，提供的資料更真實地反映基因、組織、器官的實際功能狀態(tài)。 蛋白質(zhì)芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionization-TimeofFlightMassSpectrometry，SELDI-TOF-MS)是蛋白芯片與表面加強(qiáng)激光解吸電離飛行質(zhì)譜的技術(shù)組合。優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：可直接用未經(jīng)純化的樣品進(jìn)行分析；樣品需求量少；靈敏度高；高通量。 與角膜相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究在國際

3、上處于起步階段。淚液中很多蛋白質(zhì)成分為外分泌蛋白，受眼局部因素及全身狀態(tài)的雙重影響。在一些眼病或者全身疾病的研究中，已發(fā)現(xiàn)淚液有特征性的蛋白質(zhì)成分變化.淚液中的低豐度蛋白有相當(dāng)部分具有重要的生理和病理意義。有研究表明：角膜移植術(shù)后，淚液中的IgG、sIgA、LF呈一規(guī)律變化曲線.當(dāng)捧斥反應(yīng)發(fā)生時，IgG水平異常升高，LF水平呈下降趨勢。檢測淚液中的IG含量，有助于預(yù)防角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和監(jiān)測排斥反應(yīng)是否治愈。還有研究表明急性排斥期房

4、水白蛋白、H型細(xì)胞角蛋白和α-1抗胰蛋白酶成分明顯升高，提示排斥期房水蛋白成分變化至少有三種機(jī)制：房水-血屏障的破壞、酶性降解和局部合成的蛋白釋放入房水。但是，對于血清中蛋白質(zhì)組的改變及與血清與角膜移植排斥反應(yīng)的相關(guān)分析及研究尚未見報道。 研究目的： 1.在原有動物模型基礎(chǔ)上，改進(jìn)大鼠角膜移植模型建立技術(shù)技巧，并以此為基礎(chǔ)，從組織形態(tài)學(xué)方面驗證并探討角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制； 2.利用SELDI蛋白芯片

5、技術(shù)檢測發(fā)生與未發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng)的大鼠淚液、房水以及血清的標(biāo)志蛋白表達(dá)；對照分析蛋白成分變化機(jī)制，建立診斷模型，并驗證模型的特異性與敏感性；篩選角膜移植捧斥反應(yīng)相關(guān)蛋白并分析其與角膜免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的可能機(jī)制。 研究方法： 1.建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，Wistar大鼠20只為供體，SD大鼠40只為受體，行SD大鼠右眼同種異體穿透性角膜移植，術(shù)中，Ⅰ組從角膜旁中心取植片，縫線保留長度約1mm，Ⅱ組取角膜中心

6、植片，縫線盡量剪短； 2.術(shù)后大鼠隨機(jī)分為2組，每組20只。分別為Ⅰ組排斥組(生理鹽水對照組)，Ⅱ組非排斥組(CsA滴眼液、典比殊滴眼液點眼).術(shù)后第1天開始起在裂隙燈顯微鏡下進(jìn)行臨床觀察，對角膜混濁、水腫、新生血管三項指標(biāo)進(jìn)行評分.所得數(shù)據(jù)以means±SD表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理。統(tǒng)計方法：獨立樣本t檢驗(Independent-SampleTTest)，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義； 3.兩組均于術(shù)

7、后第7天隨機(jī)取2只大鼠角膜，HE染色及常規(guī)透射電鏡觀察； 4.同時采集其他大鼠血液、淚液、房水.取血后血液在冰上靜置1h.0℃離心5000r／min10min。分離血清，與淚液、房水一并凍存于-80℃以備后用。 5.將每組18例淚液、房水標(biāo)本及16例血清標(biāo)本(每組有2例血清標(biāo)本發(fā)生凍融，放棄)隨機(jī)分為2組。取其中一組用于蛋白質(zhì)決策樹模型的建立：應(yīng)用WCX2蛋白芯片捕獲蛋白，蛋白質(zhì)離子化后，用PBSIIC型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)

8、對不同組淚液、房水及血清蛋白進(jìn)行檢測，獲得各樣本的蛋白指紋圖譜。采用CiphergcnBiosystems公司的CiphergenProteinChip3.0版本機(jī)帶分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，采用BiomarkerWizard軟件對芯片檢測得到的蛋白質(zhì)以基于最小Gini指標(biāo)方法建立決策樹模型，然后以10折交叉驗證法(10-foldCross-validationEstimates)進(jìn)行決策樹評估，找出區(qū)分兩組樣本能力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)組合；

9、 6.用另外一組標(biāo)本盲法檢測該模型的敏感性及特異性； 7.在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白質(zhì)庫中對標(biāo)志蛋白進(jìn)行初步篩選。 結(jié)果: 1.2組大鼠術(shù)后角膜轉(zhuǎn)歸情況都按預(yù)期發(fā)展，標(biāo)本采集過程對大鼠角膜及全身情況沒有影響； 2.根據(jù)大鼠同種異體穿透性角膜移植術(shù)后評分，確定在術(shù)后第7天時Ⅰ組排斥組大鼠已經(jīng)發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng)，而Ⅱ組未排斥組大鼠沒有發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng); 3.HE染色發(fā)現(xiàn)角膜植片上

10、皮基底細(xì)胞形成很多空泡，間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，大量炎性細(xì)胞浸潤，主要存在于上皮層和淺層基質(zhì)?；|(zhì)層可見新生血管官腔； 4.透射電鏡發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)發(fā)生的角膜上皮層層次紊亂，表層細(xì)胞微絨毛消失，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)不明顯，細(xì)胞間橋粒纖維化，含豐富糖原顆粒；固有層膠原微纖維平行排列規(guī)律性消失，細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)邊集，核膜不清，部分消失，周圍超微結(jié)構(gòu)不清，殘留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及豐富糖原堆積，固有層膠原角化，可見脂滴； 5.在分子量1000-20000D

11、a范圍內(nèi)： 5.1淚液 5.1.1淚液排斥與非排斥組中共有108個蛋白質(zhì)被標(biāo)記，其中有分類價值的標(biāo)志蛋白質(zhì)有11種，相對分類價值較高的有6種，其中M2167.66、M3356.53在排斥反應(yīng)組中表達(dá)下調(diào)，M1169.86、M1183.69、M9238.59、M11882.2在捧斥反應(yīng)組中表達(dá)上調(diào)； 5.1.2盲法檢測結(jié)果，該決策樹模型敏感性為78％，特異性為89％； 5.1.3蛋白質(zhì)搜庫結(jié)果提示相關(guān)蛋白可

12、能是下調(diào)蛋白：Pro-histogranin、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)；上調(diào)蛋白：β-防御素2、細(xì)胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)亞基、神經(jīng)激肽A(NKA); 5.2房水 5.2.1房水排斥與非排斥組中共有87個蛋白質(zhì)被標(biāo)記，其中相對分類價值較高的蛋白質(zhì)有6種。分別為M1037.98，M1436.29，M1326.12，M1082.37，M1067.86，M11261.6并且在排斥反應(yīng)組中表達(dá)上調(diào)；

13、5.2.2盲法檢測結(jié)果：該決策樹模型敏感性為67％，特異性為78％； 5.2.3蛋白質(zhì)搜庫結(jié)果提示相關(guān)蛋白可能是血管緊張素-1(AGT-I)、血管緊張素-2(AGT-II)、神經(jīng)肽、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β； 5.3血清 5.3.1血清排斥與非排斥組中共有58個蛋白質(zhì)被標(biāo)記，其中相對分類價值較高的蛋白質(zhì)有6種，分別為M8809.89，M7010.01，M4420.15，M3507.18，M4151.08，M1706

14、.30并且在排斥反應(yīng)組中表達(dá)上調(diào)； 5.3.2盲法檢測結(jié)果：該決策樹模型敏感性為75％，特異性為75％； 5.3.3蛋白質(zhì)搜庫結(jié)果提示相關(guān)蛋白可能是神經(jīng)肽Y，β-抵抗素、高血糖素Cortistatin(CST)。 結(jié)論： 1.通過對建立大鼠穿透性角膜移植動物模型技術(shù)的改進(jìn)以及標(biāo)本采集方法的探討，整理出一套行之有效的建立模型以及標(biāo)本采集的操作規(guī)程；保留縫線和鉆取植片部位等方法可以影響角膜移植術(shù)后的轉(zhuǎn)歸；

15、 2.術(shù)后第7天是大鼠角膜術(shù)后發(fā)生移植排斥組與未發(fā)生排斥組的分界點。是術(shù)后取材的時間點； 3.大鼠角膜移植術(shù)后臨床觀察表現(xiàn)評估與HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符； 4.透射電鏡結(jié)果表明已發(fā)生排斥反應(yīng)的角膜植片超微結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死共存。由此我們推斷，細(xì)胞凋亡的確參與了角膜移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生；. 5.應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)獲得大鼠角膜移植后淚液、房水、血清標(biāo)志蛋白表達(dá)圖譜的實驗方法穩(wěn)定

16、可行，檢測出的淚液、房水、血清中的生物標(biāo)記物可正確區(qū)分捧斥與非排斥組大鼠； 6.Pro-histogranin可能通過轉(zhuǎn)化為histogranin，β-防御素通過參與直接及間接的免疫激活作用，CST通過刺激單核細(xì)胞的分化和激活參與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)； 7.我們的試驗結(jié)果表明在淚液、房水、血清的標(biāo)志蛋白表達(dá)中均有神經(jīng)肽的上調(diào)表達(dá).這提示我們在角膜的免疫捧斥反應(yīng)的后續(xù)研究中考慮神經(jīng)遞質(zhì)是否通過刺激單核細(xì)胞的分化和激活參