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文檔簡介
1、目的:
1.研究知母-黃柏藥對在正常和糖尿病模型大鼠體內(nèi)成分;
2.建立芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂苷BⅡ、黃柏堿、木蘭花堿7種成分的血藥濃度檢測方法,探討知母-黃柏藥對給藥后,7種成分在正常和糖尿病模型大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為差異;
3.研究黃柏堿在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物及代謝途徑。
方法:
1.采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術(shù),分析在知母-黃柏藥對給藥后
2、,正常和糖尿病大鼠體內(nèi)成分,糖尿病模型采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個(gè)月后腹腔注射35 mg·Kg-1鏈脲佐菌素(STZ)建立。
色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150 mm×2.1mm,3.5μm);流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的超純水,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫,0~40 min,5%~14%B;40~60 min,14%~30%B;60~80 min,30%~50%B;80~90 min,50%~9
3、5%B;90~95 min,95%B;流速0.2 mL·min-1;柱溫30℃;PDA檢測波長范圍為200~600nm;前3 min進(jìn)廢液。
質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧ESI源;使用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式;正離子模式電噴霧電壓為4 kV;負(fù)離子模式噴霧電壓為-3.5 kV;鞘氣(ShG)為45 arb;霧化溫度為325℃;輔助氣(AG)為5 arb;吹掃氣(SwG)0 arb;一級質(zhì)譜采用傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS)掃描模式,
4、分辨率為30000;二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴掃描;分辨率為15000;碰撞能為35 eV。
鑒別方法:通過比較相同實(shí)驗(yàn)條件下得到的知母-黃柏藥對水煎液的色譜質(zhì)譜信息,給藥后樣品與空白樣品以及對照品的色譜質(zhì)譜信息比較,對比參考文獻(xiàn)等方法加以確認(rèn)。
2.通過UHPLC-LTQ-Orbitrap XL和島津液相色譜-API4000+型三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS),檢測芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂
5、苷BⅡ、黃柏堿、木蘭花堿7種成分在正常和糖尿病組大鼠體內(nèi)血藥濃度。正常和糖尿病大鼠各6只,采用單次灌胃給藥知母-黃柏藥對水提物凍干粉0.16 g·Kg-1的CMC-Na混懸液(芒果苷9.36 mg· Kg-1、新芒果苷18.592 mg· Kg-1、知母皂苷BⅡ85.84 mg· Kg-1、知母皂苷N3.68 mg·Kg-1、知母皂苷C5.104 mg·Kg-1、黃柏堿3.856 mg· Kg-1、木蘭花堿0.885 mg·Kg-1)后
6、,測定給藥后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、11和24 h正常和糖尿病大鼠各成分血藥濃度,用DAS軟件計(jì)算各成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),并用SPSS統(tǒng)計(jì)相關(guān)參數(shù),比較兩組間差異。
黃柏堿、木蘭花堿的測定:采用島津液相色譜-API4000+型三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS),內(nèi)標(biāo)為烏頭堿,采用甲醇沉淀蛋白法處理樣品。色譜柱為ZORBAXEclipse XDB-C18柱(2.1×150mm,5μm)
7、;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水,流動(dòng)相B為乙腈,梯度洗脫(0-1 min,10%-60%B;1-6min60%B),流速0.2 mL·min-1,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μ L。離子源為電噴霧ESI源,噴霧電壓IS為4000 V;霧化溫度為450℃;氣簾氣CUR為40;碰撞氣CAD為10;霧化氣GAS1為50;檢測方式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM),用于定量分析的離子對分別為342.3→297.2(木蘭花堿),342.3→192.1(黃柏堿
8、)。
芒果苷、新芒果苷、知母皂苷N、知母皂苷C、知母皂苷BⅡ的測定:采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術(shù),內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg2,采用甲醇沉淀蛋白法處理樣品。色譜柱為CORTECS(@)UPLC(@)C18(2.1×100mm,1.6μ m),流動(dòng)相A為0.1%甲酸水,流動(dòng)相B為乙腈,梯度洗脫(0-10 min,6-30%,前2.5 min進(jìn)廢液;10-18 min,30-40%;18-20min,40-90%),流
9、速0.2 mL·min-1,柱溫30℃,進(jìn)樣量10μL,分析時(shí)間20min。離子源為電噴霧ESI源,碰撞誘導(dǎo)解離(CID)檢測模式,電噴霧電壓為3.5KV,鞘氣(ShG)為45 arb,霧化溫度為325℃,輔助氣(AG)為5 arb,吹掃氣(SwG)0 arb,分辨率為30000,質(zhì)量掃描范圍m/z為200-1200。
3.采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技術(shù),在灌胃給藥黃柏堿80 mg·Kg-1后,檢測大鼠血漿
10、、膽汁、尿液和糞便中所含的代謝產(chǎn)物。色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1×150mm,3.5μm);流動(dòng)相A為0.1%的甲酸,流動(dòng)相B為乙腈,梯度洗脫(0~40 min,5%~14%B,前3 min進(jìn)廢液),流速0.2 mL·min-1,柱溫30℃。離子源為電噴霧ESI源,檢測方式為正離子碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式,電噴霧電壓為4.5KV;鞘氣(ShG)為45 arb,霧化溫度為325℃,輔助氣(AG)為5 a
11、rb,吹掃氣(SwG)0 arb,碰撞能為30 eV。MS1采用傅里葉變換質(zhì)譜(FTMS),分辨率為30000,質(zhì)量掃描范圍為215-900。MS2和MS3采用數(shù)據(jù)依賴掃描(DDS),分辨率為15000。
代謝產(chǎn)物的鑒別:利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL,比較給藥后樣品與空白樣品色譜圖,初步篩選可能的代謝產(chǎn)物峰,而根據(jù)已有的代謝生物轉(zhuǎn)化類型和黃柏堿的結(jié)構(gòu)逆向推測其可能的代謝產(chǎn)物分子量和分子結(jié)構(gòu),然后在色譜和質(zhì)譜中
12、查看是否存在,若存在,則需要對其碎片信息進(jìn)行考察,來確定其是否為黃柏堿的代謝產(chǎn)物。
結(jié)果:
1.通過本次研究,在知母-黃柏藥對給藥后,大鼠血漿中共鑒別了原型成分16個(gè),其中檢測的黃酮類、皂苷類、有機(jī)酸類成分共10個(gè),來源于知母;檢測的生物堿類成分6個(gè),來源于黃柏;代謝產(chǎn)物11個(gè),其中芒果苷類代謝產(chǎn)物6個(gè),生物堿類代謝產(chǎn)物5個(gè),正常組和糖尿病組大鼠所含成分種類無差別。
2.通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),對芒果苷、新芒果苷
13、、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C、黃柏堿、木蘭花堿7個(gè)主要成分血藥濃度檢測方法學(xué)考察,各成分在檢測條件下,線性關(guān)系良好,R均大于0.9958,準(zhǔn)確度為(90.48±6.58)%-(108.54±5.71)%,日內(nèi)和日間精密度(RSD)均≤10.54%,各條件下穩(wěn)定性結(jié)果均在(87.92±2.24)%-(110.52±3.24)%之間,專屬性好。分別給予正常組和糖尿病組大鼠0.16 g·Kg-1知母-黃柏藥對水煎液凍干粉,由建立的定
14、量方法測得知母皂苷N和黃柏堿在糖尿病組大鼠的AUC0~t顯著大于正常組,而知母皂苷C和黃柏堿的Cmax在糖尿病組大鼠顯著高于正常組。
3.通過高分辨質(zhì)譜和LC-MSn技術(shù),共鑒別了黃柏堿在體內(nèi)的25個(gè)代謝產(chǎn)物。其代謝形式主要有葡萄糖醛酸化、羥基化、脫氫、脫甲基、甲基化等。其中葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物主要鑒別于膽汁、尿液、血漿樣品中,羥基化和脫甲基化的代謝產(chǎn)物主要鑒別于糞便樣品中。
結(jié)論:
本文利用UHPLC-
15、LTQ-Orbitrap XL高分辨多級液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),在知母-黃柏藥對給藥后,鑒別正常和糖尿病大鼠血漿所含成分種類無差異。表明正常和糖尿病病理模型對知母-黃柏藥對中藥物成分進(jìn)入血液中的種類無影響。但利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),研究芒果苷、新芒果苷等7個(gè)主要成分在正常和糖尿病大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)行為,發(fā)現(xiàn):糖尿病大鼠中新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C和黃柏堿5個(gè)成分AUC0~t和Cmax均值均高于正常組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;知母皂苷N的AU
16、C0~t和知母皂苷C的Cmax均值都是糖尿病組顯著高于正常組,而黃柏堿的AUC0~t和Cmax的均值在糖尿病大鼠均顯著高于正常組,說明糖尿病病理模型對部分成分的吸收和利用有影響,這可能與其發(fā)揮降糖藥理作用相關(guān)。由于黃柏堿在兩種生理模型下藥代動(dòng)力學(xué)行為的差異顯著,本文利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL高分辨多級液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),研究知母-黃柏藥對中代表性成分黃柏堿在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品中的代謝情況,共鑒別黃柏堿的代謝產(chǎn)物
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