呋喃丹及其代謝物在保存檢材中的分解動力學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　1.建立生物樣品中呋喃丹及代謝物呋喃酚的GC-MS/MS定性定量方法；
　　2.建立保存檢材中呋喃丹及其代謝物呋喃酚的分解動力學(xué)研究方法；
　　3.為呋喃丹意外死亡和中毒案件法醫(yī)學(xué)鑒定中毒檢驗結(jié)果的分析提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.樣品處理與分析血液和肝組織樣品中加入內(nèi)標（TBP），經(jīng)酸化處理，二氯甲烷萃取。采用GC-MS/MS法定性定量分析樣品中呋喃丹及其代謝產(chǎn)物呋喃酚。
　　2.

2、呋喃丹穩(wěn)定性研究配制0.1μg/mL、0.2μg/mL、8.0μg/mL的呋喃丹標準儲備液，貯藏在4℃、﹣20℃冰箱中，分別于0d及10.0d、20.0d、34.0d檢測呋喃丹含量。取空白血液1mL和肝臟1g若干份，分別添加呋喃丹標準品，配制成濃度為0.1μg/mL（μg/g）、0.2μg/mL（μg/g）、8.0μg/mL（μg/g）的樣品；取空白血液1mL若干份，分別添加抗凝劑枸櫞酸鈉0.5mg/mL、2.5mg/mL、20.0mg

3、/mL以及添加呋喃丹標準溶液，均配制成含不同濃度抗凝劑的2.0μg/mL呋喃丹溶液的樣品。添加呋喃丹和加有枸櫞酸的樣品經(jīng)萃取揮干后，分別用封口膜封口，4℃冰箱保存。分別于0d及10.0d、20.0d、34.0d檢測呋喃丹含量。
　　3.分解動力學(xué)研究本地犬（雄性）6只，4LD50（13.5mg/kg）呋喃丹灌胃。觀察動物反應(yīng)，待呼吸心跳全部消失，分別取血液和肝臟。血液分五等份分別置于20℃（1％NaF）、20℃（NC）、20℃、4

4、℃、-20℃五種條件下保存；肝臟分四等份分別置于20℃（4%FA）、20℃、4℃、-20℃四種條件下保存。于不同時間點檢測各保存樣品中呋喃丹及其代謝物呋喃酚的含量，3p97擬合分解動力學(xué)方程，計算呋喃丹和呋喃酚在不同保存條件下不同樣品中的分解半衰期。
　　4.統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS19.0統(tǒng)計軟件，對呋喃丹和呋喃酚檢材的不同保存條件之間、不同時間之間進行配對t檢驗，比較不同保存條件和時間對呋喃丹和呋喃酚的分解動力學(xué)過程有無影響。

5、r>　　結(jié)果：
　　1.GC-MS/MS分析 CBF、7PH和TBP各峰形均對稱，可完全分離。血液和肝組織中 CBF、7PH工作曲線線性范圍均是：0.01~10.00μg/mL，最低檢出限0.06~0.54ng/mL，方法回收率93.4%~112.0%，RSD＜6.0%。
　　2.呋喃丹穩(wěn)定性實驗結(jié)果
　?。?）標準儲備液穩(wěn)定性：4℃保存0.1μg/mL~8.0μg/mL呋喃丹的標準儲備液，在20.0d~34.0d下降

6、至初始濃度的78.6%~88.8%，偏差為11.2%~21.4%，P＜0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；﹣20℃保存0.1μg/mL呋喃丹的標準儲備液，34.0d下降至初始濃度的82.5%，偏差為17.5%，P＜0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　（2）提取殘渣中的穩(wěn)定性：4℃保存的已提取的0.1μg/mL~8.0μg/mL血液和肝臟中呋喃丹的含量，7.0d~30.0d下降至初始濃度的59.5%~88.7%，偏差為11.3%~40.4%，

7、P＜0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）樣品添加枸櫞酸鈉對提取殘渣穩(wěn)定性的影響：4℃保存的已提取0.5mg/mL~20.0mg/mL枸櫞酸鈉添加血液中呋喃丹的含量，7.0d下降至初始濃度的50.3%~62.2%，偏差為37.7%~49.8%，P＜0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.呋喃丹及代謝物呋喃酚在保存檢材中的分解動力學(xué)
　?。?）分解動力學(xué)：呋喃丹、呋喃酚在保存檢材中的分解動力學(xué)符合一級動力學(xué)過程，20℃（

8、1%NaF）、20℃（NC）、20℃、4℃、-20℃保存條件下血液中呋喃丹和呋喃酚，分解半衰期分別為2.0d±0.1d、2.4d±0.1d、3.3d±0.1d、5.6d±0.5d、2.0d±1.0d和14.4d±6.3d、15.7d±4.9d、16.3d±11.0d、15.9d±10.0d、23.5d±9.0d。20℃（4%FA）、20℃、4℃、-20℃保存條件下肝臟中呋喃丹和呋喃酚，分解半衰期分別為18.5d±4.4d、2.9d±0.

9、3d、3.3d±1.0d、8.3d±1.0d和19.0d±12.0d、12.3d±9.3d、28.3d±16.8d、24.7d±23.6d。
　　（2）呋喃丹和呋喃酚在不同保存條件下的含量變化：不同條件保存血液和肝臟中呋喃丹的含量均呈下降趨勢，前7.0d顯著下降（P＜0.05），隨后變化較穩(wěn)定。20℃（1%NaF）、20℃（NC）、20℃、4℃、-20℃保存條件下血液中呋喃丹含量在7.0d和83.0d分別下降至初始濃度的10.2%

10、~51.0%和0%~6.9%，檢出時限為83.0d~150.0d。20℃（4%FA）、20℃、4℃、-20℃保存條件下肝臟中呋喃丹的含量7.0d和150.0d分別下降至初始濃度的18.7%~58.7%和0%~7.2%，檢出時限為83.0d~150.0d。
　　不同條件保存血液和肝臟中呋喃酚的含量均呈先升高后下降趨勢，0d即可檢測到呋喃酚。20℃（1%NaF）、20℃（NC）、20℃、4℃、-20℃保存條件下血液中呋喃酚含量15.0

11、d顯著升高（P＜0.05），15.0d升高至初始濃度的195.0%~1339.0%和150.0d下降至初始濃度的0%~97.0%，檢出時限為83.0d~150.0d。20℃（4%FA）、20℃、4℃、-20℃保存條件下肝臟中呋喃酚含量7.0d顯著升高（P＜0.05），7.0d升高至初始濃度的182.8%~539.8%和150.0d下降至初始濃度的0%~30.9%，檢出時限為83.0d~150.0d。
　　結(jié)論：
　　1.建立

12、了血液和肝臟中測定呋喃丹、呋喃酚的GC-MS/MS分析方法，該方法簡便、靈敏、重現(xiàn)性好，適用于呋喃丹意外中毒案件的快速鑒定。
　　2.呋喃丹的標準儲備液在﹣20℃和4℃條件下保存均可發(fā)生分解，﹣20℃條件下分解速度較4℃慢，高濃度較低濃度分解速度慢，偏差小。提示呋喃丹的標準儲備液應(yīng)在﹣20℃且高濃度條件下保存。標準儲備液濃度與新配制的儲備液濃度的偏差不應(yīng)超過5%，提示4℃和﹣20℃保存0.1μg/mL、0.2μg/mL、8.0μg

13、/mL呋喃丹標準儲備液的有效期分別在10.0d、10.0d、20.0d內(nèi)和10.0d、20.0d、34.0d內(nèi)。
　　呋喃丹在4℃保存的已提取檢材（血液和肝臟）中，高濃度較低濃度保存濃度變化小，偏差小。在穩(wěn)定性考察中，其可接受標準為樣品與真實濃度的偏差不超過15%。提示4℃保存的已提取的呋喃丹濃度為0.1μg/mL、0.2μg/mL、8.0μg/mL血液和肝臟中，檢材檢測有效期分別為7.0d、15.0d、15.0d內(nèi)和7.0d、7

14、.0d、15.0d內(nèi)。
　　呋喃丹在枸櫞酸鈉提取后保存檢材中，枸櫞酸鈉濃度越高，呋喃丹下降速度越快，偏差越大，說明枸櫞酸鈉可加快呋喃丹的分解。提示4℃保存的枸櫞酸鈉已提取檢材，在保存7.0d后不能代表檢材采取當(dāng)時的濃度，不建議作為樣品繼續(xù)檢測。
　　呋喃丹在各保存條件下的有效期，為呋喃丹中毒檢測提供了參考。
　　3.呋喃丹及其代謝物呋喃酚在各保存條件下均可發(fā)生分解，20℃保存分解較快，-20℃分解速度最慢，血液中呋喃丹

15、和呋喃酚在枸櫞酸鈉和氟化鈉保存條件下分解速度加快。在呋喃丹的意外死亡和中毒的實際案件中，檢材應(yīng)及時送檢，低溫保存，并同時檢測呋喃丹和呋喃酚，不適宜分別用枸櫞酸鈉和氟化鈉作抗凝劑和防腐劑。
　　4.呋喃丹及其代謝物呋喃酚在保存檢材中的分解動力學(xué)符合一級動力學(xué)過程，根據(jù)動力學(xué)方程計算的理論值與實測值符合情況良好，利用該分解動力學(xué)方程，可以推測檢材采取當(dāng)時血液和肝臟中呋喃丹的含量，為呋喃丹意外死亡和中毒案件法醫(yī)學(xué)鑒定中毒檢驗結(jié)果的分析提