北沙參在大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定與北沙參-麥冬配伍的藥物動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根，為臨床常用中藥?！吨袊?guó)藥典》記載其具有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效，可用于治療肺熱燥咳、勞嗽痰血、熱病津傷口渴等癥。香豆素是北沙參中的一類主要活性成分，種類多樣。目前為止，北沙參中香豆素類成分在體內(nèi)的代謝物尚無(wú)系統(tǒng)的研究。中藥本身成分復(fù)雜，進(jìn)入體內(nèi)后組成更為復(fù)雜，且含量較低。如何在如此復(fù)雜的體系中準(zhǔn)確、快速地鑒定中藥進(jìn)入體內(nèi)的成分，成

2、為中藥能否深入研究的關(guān)鍵。UPLC/qTOF-MS技術(shù)靈敏度高、分離能力強(qiáng)，能夠提供準(zhǔn)確的分子量，并預(yù)測(cè)元素組成，成為中藥進(jìn)入體內(nèi)后的成分及其代謝物的定性與定量研究的有力工具。本研究即采用該技術(shù)，建立一種普適性的中藥體內(nèi)代謝物發(fā)現(xiàn)和鑒定的有效方法，并用于北沙參提取液在大鼠尿液、膽汁和血漿中的代謝物的鑒定，推測(cè)可能的代謝途徑。
　　北沙參和麥冬均是滋陰清熱之中藥，臨床配伍應(yīng)用歷史悠久。兩藥相輔相成，相須為用，肺胃心三臟同治，其功效更

3、著。兩藥配伍機(jī)制目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究采用UPLC/qTOF-MS技術(shù)，對(duì)單獨(dú)給與北沙參和麥冬以及兩藥配伍給與大鼠后主要成分的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，為其配伍機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分北沙參在大鼠體內(nèi)吸收組分與其代謝物的鑒定
　　目的:采用UPLC/qTOF-MS技術(shù)，建立一種普適性的中藥體內(nèi)代謝物發(fā)現(xiàn)和鑒定的有效方法，并用于北沙參在大鼠尿液、血漿和膽汁中代謝物的鑒定。
　　方法:
　　1北沙參灌胃提取液的

4、制備:將北沙參按照傳統(tǒng)水煎工藝提取，減壓濃縮至相當(dāng)于0.4 g/mL北沙參，加入4倍量無(wú)水乙醇沉淀，抽濾，減壓除醇，用水稀釋至相當(dāng)于2 g/mL的原藥材。
　　2生物樣品的采集和預(yù)處理:取9只雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±10 g，隨機(jī)分為3組，每組3只，按體重以1 mL/100 g的給藥量，灌胃給與大鼠，分別采集給藥后72 h的尿液、24 h的膽汁樣品和0.17、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12和2

5、4 h時(shí)的血漿樣品，分別合并所有的尿樣、膽汁和血漿樣品。將合并的生物樣品分別用3倍量的乙酸乙酯萃取，萃取3次，每次10 min。合并乙酸乙酯層，減壓干燥，殘?jiān)眉状既芙狻?br>　　3樣品分析條件:采用UPLC/qTOF-MS技術(shù)分析樣品。色譜柱為Kinelex2.6μC18100A(1002.10 mm)（菲羅門），預(yù)柱為SecurityGuardUHPLC C18柱，流動(dòng)相為甲醇和1mmol/L的乙酸銨水溶液，梯度洗脫;高分辨質(zhì)譜采

6、用ESI源，正離子模式，全掃描采集，采用動(dòng)態(tài)背景扣除和信息依賴采集觸發(fā)二級(jí)碎片的采集，每一循環(huán)采集8個(gè)最強(qiáng)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖。運(yùn)行時(shí)間為35 min。
　　4代謝物發(fā)現(xiàn)和鑒定的步驟:首先結(jié)合文獻(xiàn)，建立北沙參中香豆素類已知化合物的信息庫(kù)。然后用PeakView1.2軟件尋找主要的吸收組分。再將這些吸收組分按照結(jié)構(gòu)的相似性分類，選擇每類中的典型化合物。接著采用Metabolitepilot1.5軟件，對(duì)這些典型化合物進(jìn)行分析，尋找尿樣、膽

7、汁和血漿樣品中這些化合物的代謝物。最后根據(jù)香豆素類的裂解規(guī)律和化合物的極性，對(duì)這些代謝物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，推斷可能的代謝產(chǎn)物，并推測(cè)可能的生物轉(zhuǎn)化途徑。
　　結(jié)果:通過(guò)PeakView1.2，在給藥后的生物樣品中尋找到20種主要的吸收組分;按結(jié)構(gòu)將其分為5類，分別以東莨菪內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、歐前胡素、6-(3，3-二甲烯丙基)-7-羥基香豆素和異紫花前胡內(nèi)酯為典型成分;利用Metabolitepilot1.5軟件分析這些典型成分，尋找

8、并初步鑒定其代謝物，共鑒定出111種成分，主要的代謝類型為氧化、甲基化、水解、氫化、和硫酸結(jié)合等。
　　結(jié)論:本研究采用UPLC/qTOF-MS技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)和鑒定了北沙參大鼠體內(nèi)代謝物，為北沙參體內(nèi)過(guò)程的闡明奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為中藥進(jìn)入體內(nèi)的成分分析提供了有效手段。
　　第二部分北沙參-麥冬配伍的藥物動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:建立生物樣品中北沙參和麥冬中主要成分的UPLC/qTOF-MS定量測(cè)定方法，研究北沙參-麥冬配伍給

9、與大鼠的藥物動(dòng)力學(xué)特征，初步探討二者配伍的藥物動(dòng)力學(xué)相互影響，為北沙參-麥冬配伍機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1北沙參、麥冬和北沙參-麥冬配伍灌胃液的制備:按照傳統(tǒng)水煎工藝，分別制備北沙參和麥冬的水提液。將此提取液分別減壓濃縮8倍和4倍，進(jìn)行冷凍干燥，得到北沙參和麥冬水提物粉末。加適量水溶解，分別制備成北沙參灌胃液（相當(dāng)于1 g/mL的北沙參藥材）、麥冬灌胃液（相當(dāng)于1 g/mL的麥冬藥材）、北沙參-麥冬灌胃液（相當(dāng)

10、于1g/mL的北沙參藥材和1 g/mL的麥冬藥材）。
　　2生物樣品的采集和預(yù)處理:取18只270±20 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為3組，按體重以2mL/100 g的給藥量，分別灌胃給與上述3種溶液。分別于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36h眼內(nèi)眥靜脈叢取血，采用乙腈沉蛋白的方法處理血漿樣品。
　　3樣品分析條件:采用UPLC-Q-TOF技術(shù)。Phenomenex Kinet

11、ex2.6μC18100A(503.0 mm，2.6μm)色譜柱，柱前連接在線過(guò)濾器。流動(dòng)相為0.03％乙酸和乙腈。ESI電離，子離子掃描模式，北沙參中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯和歐前胡素在正離子模式下檢測(cè)，麥冬中甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、甲基麥冬高異黃酮A和麥冬皂苷D在負(fù)離子模式下檢測(cè)。采用高分辨的多重子離子加和的方法計(jì)算峰面積，并采用內(nèi)標(biāo)法加權(quán)（1/x2）一元線性回歸定量。
　　4藥物動(dòng)力

12、學(xué)研究與分析:根據(jù)測(cè)定結(jié)果，繪制藥時(shí)曲線，采用非房室模型根據(jù)公式計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并比較單獨(dú)給藥和配伍給藥的藥物動(dòng)力學(xué)差異。
　　結(jié)果:大鼠血漿中花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、歐前胡素、補(bǔ)骨脂素、麥冬皂苷D、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B和甲基麥冬高異黃酮A分別在0.040～20 ng/mL、0.040～20 ng/mL、0.040～20 ng/mL、0.06～30 ng/mL、0.06～30 ng/mL、0

13、.800～200 ng/mL、0.30～75 ng/mL、0.30～75 ng/mL和0.30～75 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.991)，最低定量限(LLOQ)≤0.04 ng/mL。批內(nèi)、批間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10.1％，相對(duì)誤差（RE）為-5.0％～8.7％。平均提取回收率為67.4％～105.5％，基質(zhì)效應(yīng)處于88.1％～112.5％范圍內(nèi)。北沙參和麥冬單次配伍給藥可以提高佛手柑內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、補(bǔ)骨