北沙參體內(nèi)外香豆素類(lèi)成分與其代謝物研究及抗腦衰膠囊質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根，為臨床常用中藥。中國(guó)藥典記載其具有養(yǎng)陰清肺，益胃生津的功效，可用于肺熱燥咳，勞嗽痰血，熱病津傷口渴等癥。香豆素是北沙參中的一類(lèi)主要活性成分。本研究以北沙參為載體，以香豆素類(lèi)成分為研究對(duì)象，以高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)和高效毛細(xì)管電泳（HPCE）技術(shù)為分析手段，探討復(fù)雜體系中中藥成分與其代謝物研究的方法學(xué)。采用HPCE技

2、術(shù)對(duì)北沙參中的香豆素類(lèi)成分進(jìn)行分析，為北沙參的質(zhì)量控制提供新的手段；采用HPLC-MS技術(shù)測(cè)定大鼠灌胃北沙參提取物后尿液和膽汁中的香豆素類(lèi)成分，并用于排泄研究；利用微生物轉(zhuǎn)化法分離與制備北沙參主要香豆素成分之一異歐前胡素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；采用HPLC-MS技術(shù)鑒定大鼠尿液、糞便、膽汁和血漿以及微生物轉(zhuǎn)化液中異歐前胡素的代謝物，并探討體內(nèi)代謝與微生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)性。
　　 抗腦衰膠囊由人參、制何首烏、黨參、黃芪、熟地黃、山藥、丹參、黃芩、

3、枸杞子、白芍、遠(yuǎn)志、茯神、石菖蒲、葛根、酸棗仁、麥冬、龍骨（粉）、香附、菊花等19味中藥材組成。用于因腎精不足、肝氣血虧所引起的精神疲憊、失眠多夢(mèng)、頭暈?zāi)垦！Ⅲw乏無(wú)力、記憶力減退。本研究建立了專(zhuān)屬、靈敏、快速的HPLC-MS法測(cè)定抗腦衰膠囊中的有效成分，并對(duì)不同批次的抗腦衰膠囊進(jìn)行了質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量控制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了有效分析方法。
　　 第一部分、膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定北沙參中5種香豆素類(lèi)成分
　　

4、 目的：建立同時(shí)分離、測(cè)定北沙參中補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯5種香豆素類(lèi)成分的膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法，并用于北沙參藥材分析。
　　 方法：采用未涂層融硅石英毛細(xì)管柱（50.2cm×75μm×40cm），20mmol/L硼砂溶液-16mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)-15％乙腈(pH9.6)為運(yùn)行緩沖液，分離電壓22kV，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。對(duì)緩沖液種類(lèi)、濃度、pH、SDS、乙腈濃度、電壓、溫度

5、等因素對(duì)分離的影響做了系統(tǒng)的考察。并采用所建立的方法對(duì)不同產(chǎn)地的16批北沙參藥材進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯在7min內(nèi)全部分離，線性范圍分別為9.91～82.6、37.2～162、2.23～18.6、2.73～22.3和2.89～20.1μg/mL，平均回收率分別為98.9％，98.4％，101.3％，99.1％和98.0％。
　　 結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，

6、為北沙參藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的手段。
　　 第二部分、大鼠尿和膽汁中9種香豆素類(lèi)成分的HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定及排泄研究
　　 目的：建立同時(shí)測(cè)定大鼠尿和膽汁中9種香豆素類(lèi)成分含量的HPLC-MS方法，并用于排泄研究。9種香豆素類(lèi)成分分別為東莨菪內(nèi)酯、花椒毒酚、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡內(nèi)酯、歐前胡素和異歐前胡素。
　　 方法：大鼠灌胃給與北沙參提取物(10mL/kg)后，分別收集不同

7、時(shí)間段的尿和膽汁。尿和膽汁均采用液-液萃取以乙酸乙酯為溶劑進(jìn)行預(yù)處理，以茴芹內(nèi)酯為內(nèi)標(biāo)。液相色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為1mmol/L的醋酸銨-甲醇，梯度洗脫。質(zhì)譜檢測(cè)采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。9種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為東莨菪內(nèi)酯m/z193.1/133.0、花椒毒酚m/z203.2/147.1、花椒毒素m/z217.2/202.0、補(bǔ)骨脂素m/z187.2/131.1、異茴芹內(nèi)酯m/z247.

8、1/217.0、佛手柑內(nèi)酯m/z217.1/202.0、氧化前胡內(nèi)酯m/z287.2/203.1、歐前胡素m/z271.1/203.2、異歐前胡素m/z271.1/203.2和茴芹內(nèi)酯m/z247.1/232.1。
　　 結(jié)果：所有的標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9982)，日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于8.7％，相對(duì)誤差(RE)為-9.4％～7.1％。平均提取回收率為85.2％～110.0％。9種香

9、豆素類(lèi)成分在尿中60小時(shí)內(nèi)基本排泄完全，在膽汁中16小時(shí)內(nèi)基本排泄完全，且9種成分以原型形式的排泄量均低于15％。
　　 結(jié)論：該法靈敏度高、選擇性好、精密度好，適用于大鼠灌胃北沙參提取物后尿和膽汁中9種香豆素類(lèi)成分的排泄研究。
　　 第三部分、異歐前胡素的微生物轉(zhuǎn)化研究
　　 目的：研究異歐前胡素的微生物轉(zhuǎn)化，分離鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
　　 方法：從15種真菌中篩選出對(duì)異歐前胡素有轉(zhuǎn)化能力的菌株，從中選出1株

10、轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化放大實(shí)驗(yàn)。分別采用硅膠和制備高效液相色譜等技術(shù)分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，通過(guò)HPLC-MS和核磁共振（NMR）技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：對(duì)異歐前胡素轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的菌株是短刺小克銀漢霉AS3.970。在AS3.970對(duì)異歐前胡素的轉(zhuǎn)化液中分離得到了異歐前胡素的4個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分別為水合氧化前胡素、E-5-（4-羥基-3-甲基丁-2-烯氧基）-補(bǔ)骨脂素、Z-5-（4-羥基-3-甲基丁-2-烯氧基）-補(bǔ)骨脂素

11、和5-（2-羥基-3-甲基丁氧基）-補(bǔ)骨脂素。
　　 結(jié)論：4種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均為異毆前胡素微生物轉(zhuǎn)化首次分離，其中E-5-（4-羥基-3-甲基丁-2-烯氧基）-補(bǔ)骨脂素為新化合物。
　　 第四部分、異歐前胡素體內(nèi)代謝物與微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC-MS法鑒定及二者相關(guān)性探討
　　 目的：建立靈敏、有效的LC-MS方法，用于鑒定大鼠尿液、糞便、膽汁和血漿中異歐前胡素的代謝物及微生物轉(zhuǎn)化液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并探討體內(nèi)代謝與微生

12、物轉(zhuǎn)化的相關(guān)性。
　　 方法：灌胃給與大鼠異歐前胡素，收集不同時(shí)間段（點(diǎn)）的尿液、糞便、膽汁和血漿樣品；采用短刺小克銀漢霉AS3.970轉(zhuǎn)化異歐前胡素，得到微生物轉(zhuǎn)化液。聯(lián)合采用串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜增強(qiáng)型全掃描-信息依賴(lài)-增強(qiáng)型子離子掃描(EMS-IDA-EPI)、多離子監(jiān)測(cè)-信息依賴(lài)-增強(qiáng)型子離子掃描(MIM-IDA-EPI)和母離子掃描-信息依賴(lài)-增強(qiáng)型子離子掃描(PREC-IDA-EPI)3種模式分析鑒定異歐前胡素在大

13、鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。根據(jù)增強(qiáng)型全掃描圖中同時(shí)出現(xiàn)的[M+H]+和[M+Na]+離子以及母離子掃描圖中同時(shí)出現(xiàn)的[M+H]+和[M+NH4]+離子判斷未知代謝物的分子量，為了保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，進(jìn)一步采用高分辨質(zhì)譜確定代謝物的準(zhǔn)確分子量，根據(jù)碎片離子信息推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)。采用C18柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為1mmol/L的醋酸銨-甲醇，梯度洗脫。
　　 結(jié)果：根據(jù)呋喃香豆素類(lèi)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并與對(duì)照品比較，鑒定出異歐

14、前胡素在大鼠體內(nèi)的代謝物19個(gè)，短刺小克銀漢霉AS3.970轉(zhuǎn)化產(chǎn)物13個(gè)。
　　 結(jié)論：本法靈敏、有效，可成功用于異歐前胡素在大鼠體內(nèi)代謝物及微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，異歐前胡素在大鼠體內(nèi)的代謝物與微生物轉(zhuǎn)化具有很好的相關(guān)性；且EMS-IDA-EPI、MIM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI掃描模式聯(lián)用技術(shù)在化合物結(jié)構(gòu)鑒定方面具有超過(guò)其單一模式的優(yōu)越性，對(duì)未知代謝物結(jié)構(gòu)研究具有重要意義。
　　 第五部

15、分、抗腦衰膠囊的質(zhì)量控制方法研究
　　 目的：建立一種測(cè)定抗腦衰膠囊中40種化學(xué)成分的HPLC-ESI-MS/MS方法，并用于抗腦衰膠囊的質(zhì)量控制。
　　 方法：色譜柱為AgilentC18柱，流動(dòng)相為0.1％甲酸水-甲醇，梯度洗脫。采用串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行檢測(cè)，并采用所建立的方法對(duì)10批抗腦衰膠囊進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：所有的標(biāo)準(zhǔn)曲線在線