中藥白頭翁質(zhì)量控制和白樺脂酸體內(nèi)外代謝研究.pdf

1、白頭翁（Pulsatilla chinensis（Bge.）Regel）為毛茛科（Ranunculaceae）白頭翁屬（Pulsatilla）植物，是常用的傳統(tǒng)中藥之一，具有清熱解毒、燥濕殺蟲(chóng)和涼血止痢等功效。臨床上被廣泛地用于細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、陰道滴蟲(chóng)、細(xì)菌感染和惡性腫瘤等疾病的治療。白頭翁在我國(guó)河北、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、安徽、河南以及湖北等省均有廣泛分布，且不同產(chǎn)地的白頭翁化學(xué)成分存在明顯差異。因此，定量和定性分析白頭翁中主要

2、的有效成分對(duì)于藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)十分重要。中藥作為復(fù)雜成分體系，其質(zhì)量控制研究需圍繞“多成分”、“多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。故本研究建立了液質(zhì)聯(lián)用（UPLC-ESI-MS/MS）技術(shù)結(jié)合組織破碎法同時(shí)測(cè)定白頭翁中12個(gè)主要化學(xué)成分含量的方法，并采用主成分分析方法對(duì)不同產(chǎn)地的白頭翁進(jìn)行質(zhì)量分析，為白頭翁藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。建立UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析總結(jié)五環(huán)三萜皂苷類成分及其同分異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并且結(jié)合全面、系統(tǒng)的五環(huán)三萜皂

3、苷類化合物的定性分析策略，快速識(shí)別和鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化合物以及同分異構(gòu)體。最終鑒定出22個(gè)五環(huán)三萜皂苷類化合物，并且區(qū)分兩大類、11對(duì)同分異構(gòu)體。本研究為闡明中藥材質(zhì)量差異提供了有效的技術(shù)手段，并為富含五環(huán)三萜皂苷類成分中藥的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，從而為全面深入地研究中藥活性化學(xué)成分與中藥藥效的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。
　　白樺脂酸（Betulinic acid, BA）是一種五環(huán)三萜類有機(jī)酸，為白頭翁中主要活性成分之一。藥理學(xué)

4、研究表明其對(duì)HIV-1型感染具有抑制作用，并且具有抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)建立借助UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)鑒定白樺脂酸體內(nèi)外代謝物的檢測(cè)方法，并將其運(yùn)用于給藥大鼠糞便及微生物轉(zhuǎn)化的代謝物鑒定，并推斷其代謝途徑，探尋白樺脂酸在體內(nèi)的代謝過(guò)程，為白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類成分的體內(nèi)代謝研究提供理論依據(jù)。
　　第一部分：液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定白頭翁藥材中12種主要化學(xué)成分及其主成分分析
　　目的：建立UPLC-ESI-MS/MS方法

5、同時(shí)測(cè)定白頭翁藥材中β-蛻皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人參皂苷S、白頭翁皂苷C、23-羥基羽扇豆-20（29）-烯-28-酸-3-O-[阿拉伯糖基-吡喃鼠李糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]（C47H76O17）、白頭翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羥基白樺脂酸和常春藤皂苷元12種成分的含量，并采用主成分分析方法（PCA）對(duì)不同產(chǎn)地白頭翁進(jìn)行質(zhì)量分析，為白頭翁藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和質(zhì)量控制提供依

6、據(jù)。
　　方法：采用Phenomenex Kinetex-C18色譜柱（100×3 mm，2.6m），流動(dòng)相為甲醇含0.1％甲酸-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫為40oC。采用電噴霧離子源進(jìn)行正、負(fù)離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定量測(cè)定。離子源溫度為150oC，毛細(xì)管電壓為2.0 kV，脫溶劑氣溫度為500oC，脫溶劑氣流量為800 L/Hr，錐孔氣流量為150 L/Hr，霧化氣壓力為7.0 Ba

7、r，接口處加熱。
　　結(jié)果：12種主要化學(xué)成分的峰面積和濃度在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，儀器重復(fù)性、日內(nèi)和日間精密度、溶液穩(wěn)定性均符合要求。平均加樣回收率為97.6-104.2%，RSD小于4.7%。定量分析結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的33批白頭翁藥材中均含有刺人參皂苷S，然而其在不同產(chǎn)地藥材中的含量具有明顯的差異。PCA結(jié)果顯示，33批樣品在主成分空間中聚集成兩大類，表明產(chǎn)地對(duì)藥材的質(zhì)量差異產(chǎn)生一定的影響。
　　結(jié)論：本研究建立

8、的分析方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于白頭翁藥材中多種活性成分的同時(shí)定量測(cè)定。同時(shí)， PCA法可為白頭翁藥材分類和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，有助于合理、規(guī)范地指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥。
　　第二部分：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)快速鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化合物
　　目的：研究并總結(jié)五環(huán)三萜皂苷類化合物在正負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立全面、系統(tǒng)的化合物鑒定分析策略，鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷化

9、學(xué)成分及同分異構(gòu)體。
　　方法：首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描模式，研究了8個(gè)具有代表性的五環(huán)三萜皂苷類成分對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑，總結(jié)其規(guī)律。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，建立白頭翁屬植物五環(huán)三萜皂苷化合物的質(zhì)譜庫(kù)。通過(guò)對(duì)化合物精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子信息和保留時(shí)間分析，鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化學(xué)成分。色譜柱為Agilent Poroshell120 SB-C18色譜

10、柱（2.1 mm×100 mm，2.7μm），柱前具有配套的預(yù)柱；柱溫為40oC；流動(dòng)相為水-0.1%甲酸（A）~甲醇-0.1%甲酸（B），流速為0.3 mL/min，采用梯度洗脫方式，進(jìn)樣前預(yù)平衡10 min，進(jìn)樣量為5μL。
　　結(jié)果：通過(guò)與對(duì)照品的色譜行為、精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片信息對(duì)比，分別對(duì)8個(gè)五環(huán)三萜皂苷色譜峰進(jìn)行歸屬。峰3、4、7、14、17、18、21和22分別被鑒定為白頭翁皂苷B4、常春藤皂苷C、白頭翁皂苷C、常春

11、藤皂苷B、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羥基白樺脂酸和常春藤皂苷元。同時(shí)，基于化合物鑒定分析策略推斷出22個(gè)（11對(duì)）五環(huán)三萜皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：本研究所建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，其分析策略可為白頭翁屬其他植物以及傳統(tǒng)中藥化學(xué)成分的定性分析鑒定提供有力的技術(shù)支持，對(duì)控制中藥材質(zhì)量具有十分重要的意義。
　　第三部分：UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定白樺脂酸大鼠體內(nèi)外代謝

12、物
　　目的：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)大鼠口服給予白樺脂酸后糞便中的代謝產(chǎn)物及腸道菌微生物轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并推測(cè)其代謝途徑。
　　方法：首先，采用液-液萃取方法對(duì)生物樣品進(jìn)行預(yù)處理， UPLC-Q-TOF-MS/MS方法采集數(shù)據(jù)。第二步，運(yùn)用MetabolitePilot1.5軟件中的多種數(shù)據(jù)后處理技術(shù)（提取離子流色譜、多重質(zhì)量虧損過(guò)濾、碎片離子過(guò)濾和中性丟失過(guò)濾）對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確快速的提

13、取和識(shí)別，獲得代謝物的精確質(zhì)量數(shù)、元素組成和MS/MS質(zhì)譜圖。最后根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、相關(guān)的生物代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律和白樺脂酸的裂解規(guī)律，對(duì)白樺脂酸的代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷并且利用Clog P值輔助區(qū)分同分異構(gòu)體。
　　結(jié)果：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，大鼠口服給予白樺脂酸后糞便樣品及腸道菌微生物轉(zhuǎn)化樣品中除母藥外共檢測(cè)到46個(gè)代謝物，腸道菌微生物轉(zhuǎn)化樣品檢測(cè)到20個(gè)代謝物，大鼠糞便樣品檢測(cè)到35個(gè)代謝物，有7個(gè)代謝物在兩種生物樣