歐前胡素體內(nèi)外代謝研究及半枝蓮質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、歐前胡素為線型呋喃香豆素，是北沙參、白芷和獨(dú)活等傘形科植物的有效成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用。歐前胡素的排泄研究表明，歐前胡素僅有少量以原型形式排出體外，提示歐前胡素在體內(nèi)易發(fā)生生物轉(zhuǎn)化。本研究以歐前胡素為研究對象，以高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)為分析手段，探討歐前胡素體內(nèi)外代謝情況。采用HPLC-QTrap-MS技術(shù)鑒定大鼠灌胃歐前胡素后尿液、糞便、膽汁以及肝微粒體孵化液中的代謝物，并探討體內(nèi)外代謝的相關(guān)性

2、。同時，采用HPLC-QTof-MS技術(shù)進(jìn)一步分析大鼠灌胃歐前胡素后尿液樣品，結(jié)合兩部分的鑒定結(jié)果，總結(jié)歐前胡素及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，闡明歐前胡素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑及轉(zhuǎn)化規(guī)律，為歐前胡素及其它呋喃香豆素的代謝研究提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　半枝蓮為唇形科(Labiatae)植物半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)的干燥全草，臨床上主要用于治療癌癥、炎癥以及泌尿系統(tǒng)等疾病。半枝蓮產(chǎn)地廣泛，不同產(chǎn)地和采收

3、季節(jié)的半枝蓮的化學(xué)成分也存在差異，臨床上半枝蓮及其偽品的混淆較為常見。本研究建立了專屬、靈敏、快速的HPLC-MS/MS方法同時測定半枝蓮中7種黃酮和4種酚酸類成分，用于18批不同產(chǎn)地藥材及3批偽品的比較與評價，為半枝蓮的質(zhì)量控制提供了有效分析方法。
　　第一部分歐前胡素體內(nèi)外代謝研究
　　目的：1.建立靈敏、有效的HPLC-QTrap-MS方法，同時鑒定大鼠灌胃歐前胡素后尿液、糞便、膽汁及肝微粒體孵化液中的代謝產(chǎn)物，并探討

4、體內(nèi)代謝與肝微粒體轉(zhuǎn)化的相關(guān)性。2.應(yīng)用HPLC-QTof-MS技術(shù)分析大鼠灌胃歐前胡素后尿液樣品，推測歐前胡素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。
　　方法：1.聯(lián)合應(yīng)用HPLC-QTrap-MS技術(shù)的MRM/MIM-IDA-EPI(多離子監(jiān)測-信息依賴-增強(qiáng)型子離子掃描)、PREC-ER-IDA-EPI(母離子掃描-增強(qiáng)分辨率掃描-信息依賴-增強(qiáng)型子離子掃描)和EPI(增強(qiáng)型子離子掃描)模式鑒定大鼠灌胃歐前胡素后尿液、糞便、膽汁和肝微粒體孵

5、化液中的代謝產(chǎn)物。依據(jù)PREC-ER-IDA-EPI中的[M+H]+和[M+NH4]+離子判斷代謝物的分子量，結(jié)合3種模式的EPI信息對代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。2.采用HPLC-QTof-MS技術(shù)進(jìn)行TOF-MS-IDA-4MS/MS掃描，應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)Metabolite Pilot中的XIC(提取離子色譜)，MDF(質(zhì)量虧損)，PIF(母離子過濾)和NLF(中性丟失過濾)等分析功能，獲得代謝物的精確分子質(zhì)量、元素組成和一級、二級質(zhì)譜圖

6、，篩選和鑒定歐前胡素的代謝物。生物樣品采集處理方法：大鼠灌胃給與歐前胡素后，收集大鼠的尿液、糞便、膽汁，采用低溫差速離心法制備肝微粒體，溫孵歐前胡素得孵化液樣品。所有生物樣品經(jīng)液-液萃取進(jìn)行分離純化，氮?dú)獯蹈刹⒂眉状紡?fù)溶。實驗采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱進(jìn)行分離，梯度洗脫，流動相為甲醇-1 mmol/L的醋酸銨，流速為1.0mL/min。
　　結(jié)果：1

7、.采用HPLC-QTrap-MS技術(shù)，鑒定出尿樣中32個代謝物、糞樣中14個代謝物，膽汁中6個代謝物以及肝微粒體轉(zhuǎn)化17個代謝物，歐前胡素體內(nèi)外代謝具有較好的相關(guān)性。2.采用HPLC-QTof-MS技術(shù)，鑒定出尿樣中51個代謝物(44個Ⅰ相代謝物和7個Ⅱ相代謝物)，并推斷出歐前胡素在體內(nèi)可能的代謝途徑。
　　結(jié)論：1.HPLC-QTrap-MS方法靈敏、有效，且MRM/MIM-IDA-EPI、PREC-ER-IDA-EPI和EPI

8、模式聯(lián)合應(yīng)用在代謝鑒定方面具有超越單一模式的優(yōu)越性。2.HPLC-QTof-MS方法靈敏度高、專屬性好、準(zhǔn)確度高、簡便快捷，在單一運(yùn)行中即可鑒定代謝物，是研究藥物代謝的一種切實可行的方法。結(jié)合兩部分鑒定結(jié)果表明：(1)歐前胡素在大鼠體內(nèi)發(fā)生廣泛的生物轉(zhuǎn)化。(2)主要在肝臟中代謝并經(jīng)腎臟排泄。(3)推斷出歐前胡素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。(4)歐前胡素的體內(nèi)外生物轉(zhuǎn)化具有較好的相關(guān)性。
　　第二部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時測定半枝蓮及其偽品中黃

9、酮和酚酸類成分
　　目的：建立HPLC-MS/MS方法同時測定半枝蓮及其偽品中7種黃酮和4種酚酸類成分，并結(jié)合聚類分析用于控制半枝蓮的質(zhì)量。
　　方法：采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式同時測定7種黃酮類和4種酚酸類成分。ESI源，負(fù)離子監(jiān)測模式，源噴射電壓為-4500 V，離子源溫度為650℃。11種被測成分的監(jiān)測離子對分別為153.0/108.9(原兒茶酸)、353.1/191.0(綠原酸)、121.0/91.9(對羥基苯甲醛

10、)、461.1/285.0(野黃芩苷)、609.3/301.1(橙皮苷)、147.0/103.0(肉桂酸)、271.0/151.0(柚皮素)、285.0/133.0(木犀草素)、269.0/117.0(芹菜素)、269.0/223.0(黃芩素)和283.0/267.9(漢黃芩素)。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 column(150mm×4.6 mm，5μm)，流動相為甲醇-0.1‰乙酸水，梯度洗脫，分析時間13 m

11、in，柱溫25℃，流速0.8 mL/min。采用所建立的方法對18批半枝蓮及3批偽品進(jìn)行了測定，并采用聚類分析對21批樣品進(jìn)行歸類。
　　結(jié)果：11種化學(xué)成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性、檢測限和定量限均符合要求。平均加樣回收率為94.2～110.0％，精密度RSD為1.0～4.8％。樣品測定結(jié)果表明，半枝蓮的產(chǎn)地和采收時間對11種活性成分的含量有影響，半枝蓮及其偽品的化學(xué)成分差異較大。