酶解白頭翁皂苷及其產(chǎn)物的分離提純.pdf

1、本論文以得到高活性的白頭翁低糖基皂苷為目標(biāo),從中草藥白頭翁提取的皂苷中分離提純單體皂苷,并篩選出水解單體皂苷生物活性較高的白頭翁皂苷酶,考察酶解白頭翁皂苷的反應(yīng)條件,并進(jìn)一步進(jìn)行酶反應(yīng)產(chǎn)物的分離提純.通過測(cè)定酒精濃度和浸取溫度對(duì)白頭翁皂苷浸取液中皂苷、蛋白質(zhì)、還原糖浸出量的影響,確定蛋白質(zhì)還原糖浸出量低,皂苷浸出量高的提取白頭翁皂苷的最佳條件為:酒精濃度70％、溫度70℃、浸取時(shí)間6小時(shí).500g白頭翁分離得到47.2g白頭翁皂苷,提取

2、率為9.4％,硅膠柱分離提純得到22.2g單體白頭翁皂苷Ⅲ,得率為20.8％,多次層析,TLC鑒定白頭翁皂苷Ⅲ為3-O-[α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖苷]-3 β,23-羥基-△<'20(29)>-羽扇豆烯-28-O-[α-L-鼠李糖基(1→4)-β-D-葡萄糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖酯苷.通過考察六種菌株產(chǎn)酶對(duì)白頭翁皂苷Ⅲ的水解情況,篩選出產(chǎn)較高生物活性白頭翁皂苷酶的菌株是sp.00.白頭翁皂苷酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)

3、間為4天.DEAE-Cellulose離子交換層析法分離提純白頭翁皂苷酶,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定酶蛋白分子量,結(jié)果表明:第53、54管提純酶水解白頭翁皂苷能力較強(qiáng),為我們所要的白頭翁皂苷酶;電泳結(jié)果表明53、54管酶液在電泳圖譜中均為單帶,且遷移率相同,確定其分子量約為58KDa.白頭翁皂苷酶最適酶反應(yīng)條件為底物濃度0.2％,反應(yīng)溫度40℃、pH值5.0、反應(yīng)時(shí)間24小時(shí).實(shí)驗(yàn)中還考察了金屬離子對(duì)酶活的影響:Fe<'3+>10m

4、M時(shí)對(duì)反應(yīng)有激活作用,其余濃度是抑制作用;Ca<'2+>10mM、50mM時(shí)對(duì)反應(yīng)有激活作用,其余是抑制作用;Mg<'2+>全部是抑制作用;Zn<'2+>50mM、100mM對(duì)反應(yīng)有激活作用,其余是抑制作用;Cu<'2+>在5mM、10mM時(shí)是激活作用,其余是抑制作用.在酶反應(yīng)產(chǎn)物的分離提純過程中得到產(chǎn)物Ⅰ和產(chǎn)物Ⅱ,其中產(chǎn)物Ⅰ重量轉(zhuǎn)化率為31.7％,純品產(chǎn)物Ⅰ1.9g,產(chǎn)率為16.5％,;產(chǎn)物Ⅱ重量轉(zhuǎn)化率為15.7％,純品產(chǎn)物Ⅱ0.6g