河北道地藥材白芷和北沙參質(zhì)量控制及白芷香豆素類成分的藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、白芷和北沙參作為中國傳統(tǒng)中藥，在河北省均有廣泛種植與分布，為河北省道地中藥材。二者均是傘形科植物的干燥根，其主要成分是香豆素類化合物。近幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了一定程度的研究，包括化學(xué)成分、質(zhì)量控制、藥理作用及作用機(jī)理等。本課題在總結(jié)前人研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì)兩種藥材的化學(xué)組成、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)以及藥代動(dòng)力學(xué)方面進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)其有效的和科學(xué)的質(zhì)量控制。
　　 本研究結(jié)合硅膠柱層析、制備HPLC等方法對(duì)白芷醇提取物

2、進(jìn)行分離純化，從中得到6種香豆素類化合物，在此基礎(chǔ)上建立了白芷11種香豆素類化合物的HPLC-MS定性定量分析方法，并初步探討了大鼠灌胃白芷提取物后主要香豆素成分的藥動(dòng)學(xué)特性。建立了北沙參藥材的HPLC指紋圖譜分析方法，并利用相似度軟件對(duì)不同產(chǎn)地的北沙參指紋圖譜分析結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。另外，本研究還建立了同時(shí)測定北沙參藥材中6種香豆素類化合物含量的HPLC分析方法。
　　 本課題結(jié)合了天然藥物化學(xué)、分析化學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)等的方法和手段

3、，研究了中藥白芷和北沙參的化學(xué)成分、質(zhì)量評(píng)價(jià)及體內(nèi)過程，為中藥做了有意義的探索。
　　 第一部分
　　 河北道地藥材白芷香豆素類成分的分離制備與含量測定以及藥動(dòng)學(xué)研究
　　 目的：1.從白芷中分離制備補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cnidilin和異歐前胡素6種香豆素類單體成分。2.利用HPLC-MS的方法對(duì)白芷中11種香豆素化合物進(jìn)行定性、定量研究。3.利用HPLC的方法對(duì)白芷中5種香豆素化合物進(jìn)

4、行了藥動(dòng)學(xué)研究。
　　 方法：1.白芷化學(xué)成分的制備：結(jié)合硅膠柱層析、制備HPLC等方法對(duì)白芷醇提取物進(jìn)行分離純化，通過薄層、UV、HPLC、1H NMR，13C NMR和MS等方法對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。2.含量測定：（1）樣品處理方法：比較了不同提取方式、提取溶劑及提取時(shí)間對(duì)白芷有效成分的提取效率，選擇重復(fù)性好，提取效率高的提取方法。（2）色譜條件的優(yōu)化：考察了不同的流動(dòng)相、質(zhì)譜條件、色譜柱等影響因素，確定最佳的色譜條件。（

5、3）樣品的定性分析：通過待測組分的保留時(shí)間、分子離子和碎片離子信息與對(duì)照品化合物信息相比較來確認(rèn)待測化合物，進(jìn)而推斷其裂解規(guī)律。（4）方法學(xué)考察：分別進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、精密度、回收率、穩(wěn)定性的研究。（5）樣品測定：在已確定的色譜條件下，測定12批白芷藥材11種香豆素化合物的含量。3.藥動(dòng)學(xué)研究：白芷乙醇提取物經(jīng)硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯（5：1，4：1，3：1，2：1，1：1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫后，收集5：1和3：1部分懸浮于0

6、.5％的羧甲基纖維素鈉水溶液中，大鼠口服給予提取物混懸液后，分別于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和24 h由眼眶靜脈取血，置于肝素化塑料離心管中，血漿樣品采用甲醇沉淀蛋白的方法，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，流速為1 ml/min，檢測波長310 nm。以血漿藥物濃度為縱坐標(biāo)，取血時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)中國藥典（2005版）中的有關(guān)規(guī)定計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)果：1.白芷化學(xué)成分的制備：提

7、取分離得到6種香豆素化合物，分別鑒定為補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cnidilin和異歐前胡素。所得6個(gè)化合物用歸一化法定量，純度均大于98％。2.含量測定：（1）提取條件的優(yōu)化：白芷用75％甲醇超聲提取30 min，使各待測組分同時(shí)達(dá)到最大的提取效率，且提取方法穩(wěn)定。（2）色譜條件的優(yōu)化：采用Waters SunfireTM C18（150 mm×4.6mm I.D.，5μm），以甲醇-0.1％甲酸水（75：25）為流

8、動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速0.8 ml/min，進(jìn)樣量5μl，柱溫室溫。ESI源：正離子檢測；檢測模式：multiple reaction monitoring（MRM）；Temperature：400℃；ionSpray Voltage：5500 V；ion Source Gas1：40 psi；ion Source Gas2：40 psi；collisionGas：Medium；curtain Gas：20 psi。（3）樣品的定性分析

9、：11種香豆素的分子離子有[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+，碎片離子有[M+H-CO]+、[M+H-C5H9O]+、[M+H-C5H8]+、[M+H-C5H8-CO]+、[M+H-C5H8-CO2]+、[M+H-CH3]+。（4）方法學(xué)考察：11種香豆素化合物的線性關(guān)系均良好（r>0.99），線性范圍分別為：340～10880、62.4～1996、216～6912、45.4～1452、19.8～635、222

10、～7104、1680～53760、1330～42560、744～23808、2.7～87.6、735～23520 ng/ml，日內(nèi)和日間精密度（RSD）分別在1.2％～4.5％和0.4％～4.0％之間，回收率范圍在92.1％～108.0％之間，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性。（5）樣品測定：12批白芷藥材中11種香豆素含量在132.8～589.3μg/g之間。3.藥動(dòng)學(xué)研究：補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、cnidilin和異歐前胡素的線性范圍

11、分別為26.0～833.3、28.1～897.8、74.9～2396.2、48.0～1536.1和45.5～1360.1ng/ml，日內(nèi)和日間精密度（RSD）分別在2.7％～14.8％和0.1％～14.5％之間，提取回收率在87.1％～109.2％之間，大鼠口服給藥后5種主要藥效成分的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：Cmax：811.4 ng/ml、588.9 ng/ml、2070.2 ng/ml、753.8 ng/ml和870.9 ng/ml；Tma

12、x：4.0 h、4.0 h、5.0 h、5.0 h和5.0 h；T1/2：8.57 h、6.13 h、6.47 h、6.86 h和6.91；k值：0.08091/h、0.11301/h、0.10701/h、0.10101/h和0.10031/h；AUC0-t：4157.4 ng h/ml、2777.6 ng h/ml、11322.1 ng h/ml、3948.5 ngh/ml和5110.8 ng h/ml；AUC0-∞：4791.8 n

13、g h/ml、2918.3 ngh/ml、12037.4 ng h/ml、4210.0 ng h/ml和5323.6 ng h/ml。
　　 結(jié)論：1.白芷化學(xué)成分的制備：成功制備了補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cnidilin和異歐前胡素，經(jīng)波譜、色譜分析，可滿足定性定量以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的需要。2.含量測定：采用HPLC-MS法建立了白芷中11種香豆素化合物同時(shí)定性、定量的測定方法，其專屬性強(qiáng)，精密度良好，

14、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為白芷藥材的質(zhì)量控制提供了良好的分析方法。3.藥動(dòng)學(xué)研究：建立了同時(shí)測定血漿中補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、cnidilin和異歐前胡素的高效液相色譜法，并將其應(yīng)用于SD大鼠口服白芷提取物后5種香豆素化合物的藥動(dòng)學(xué)研究。該方法具有較高的靈敏度和專屬性，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，符合生物樣品分析的要求。
　　 第二部分
　　 河北道地藥材北沙參HPLC指紋圖譜研究和香豆素類成分的同時(shí)測定<

15、br>　　 目的：1.指紋圖譜研究：建立河北道地藥材北沙參的HPLC指紋圖譜，得到對(duì)照指紋圖譜，并與不同產(chǎn)地北沙參藥材指紋特征相比較，計(jì)算相似度。2.含量測定：對(duì)北沙參中6種香豆素化合物（補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、cnidilin和異歐前胡素）進(jìn)行含量測定，為科學(xué)評(píng)價(jià)與有效控制北沙參藥材質(zhì)量提供新方法。
　　 方法：1.指紋圖譜研究：（1）提取條件的優(yōu)化：比較了不同提取方式、不同提取溶劑、不同提取時(shí)間的提取效果

16、，選擇提取成分較多，提取率較高的提取條件。（2）色譜條件的優(yōu)化：考察了不同的流動(dòng)相、波長、柱溫等影響因素，確定最佳的色譜條件。（3）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：在確定的色譜條件下，考察指紋圖譜中補(bǔ)骨脂素色譜峰的分離度和理論板數(shù)。（4）方法學(xué)考察：分別進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的考察。（5）指紋圖譜的建立：分別取道地北沙參藥材13批和其他不同產(chǎn)地的北沙參樣品6批，制備樣品溶液，進(jìn)行指紋圖譜分析、相似度評(píng)價(jià)。2.含量測定：（1）提取條件的優(yōu)化：比較了

17、不同提取方式、提取溶劑及提取時(shí)間對(duì)北沙參有效成分的提取效率，選擇重復(fù)性好，提取效率高的提取方法。（2）色譜條件的優(yōu)化：考察了不同的流動(dòng)相、波長、柱溫等影響因素，確定最佳的色譜條件。（3）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：在確定的色譜條件下，考察花椒毒素色譜峰的分離度和理論板數(shù)。（4）方法學(xué)考察：分別進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，精密度、回收率、穩(wěn)定性的考察。（5）樣品測定：在確定的色譜條件下，測定19批北沙參藥材中6種香豆素化合物的含量。
　　 結(jié)論：1